JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Uçuş lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman sağlam proteinler (MALDI-TOF) kütle spektrometrik analizi Matris destekli daha büyük 100 kDa

Published: September 09, 2013
doi:
10.3791/50635
,
1Institute of Structural Biology “J.P. Ebel”, UMR5075, Commissariat à L’Energie Atomique et aux Energies Alternatives (CEA), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS),Université J. Fourier

Summary

Doğru kütle ölçüm proteinlerin soruşturma sırasında önemli bir adımı temsil etmektedir. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi (MS) gibi tespiti için kullanılabilir ve önemli avantajı tuzları, deterjan ve kirleticilere karşı tolerans. Burada MALDI-MS ile 100 kDa'dan daha büyük proteinlerin analizi için erişilebilir bir yaklaşımı göstermektedir.

Abstract

Etkili proteinlerin kitleleri belirleme (yapısal biyoloji araştırmaları için örneğin) birçok biyolojik çalışmalar için önemlidir. Doğru kütle tayini bir protein primer sekanslarının doğruluğunu değerlendirmek sağlar, mutasyonları ve / veya post-translasyonel modifikasyonlar, olası protein bozulması, örnek homojenliği ve etiketleme durumunda izotop dahil derecesine (ör. 13 ° C etiketleme varlığı .)

Elektrosprey iyonizasyon (ESI) kütle spektrometresi (MS), yaygın olarak denatüre proteinlerin kütle tespiti için kullanılır, ancak verimliliği örnek tampon kompozisyonu tarafından etkilenmektedir. Özellikle de, tuzlar, deterjan ve kirleticilerin varlığı ciddi ESI-MS ile analiz protein etkinliğini zayıflatır. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) MS nedeniyle tuzu tolerans ve veri edinme ve yorumlanmış basitliği için çekici bir alternatiftirtion. Dahası, büyük heterojen bir protein (büyük 100 kDa) kütle spektrumları belirlenmesi nedeniyle ESI içinde mevcut olan yüksek şarj durumu dağılımlarının üst üste yokluğu için MALDI-MS ile daha kolaydır.

Burada flight (TOF) MALDI-zaman 100 kDa'dan daha büyük proteinlerin analizi için erişilebilir bir yaklaşım sunuyoruz. İki matris (yani 2,5-dihidroksibenzoik asit ve α-siyano-4-hidroksisinamik asit) oluşan bir karışım ve örnek tevdi edilmesi için bir yaklaşım olarak, ince tabaka yöntemin kullanımını kullanmanın avantajları göstermektedir. Ayrıca lazer enerjisinin kalibrasyonu için kullanılan standartların matris ve çözücü saflığı önemli bir rol, tartışmak ve satın alma zaman. Genel olarak, MALDI-MS ile 100 kDa'dan daha büyük proteinlerin analiz etmek için sağlam bir acemi için gerekli bilgileri sağlar.

Introduction

Yapısal biyoloji, yüksek kaliteli protein 1 üretimine dayanır ve bu nedenle protein analiz 2,3 için etkin ve güvenilir bir teknikleri ile akuple edilmesi gerekmektedir. Yapısal biyoloji bir enstitü içinde bizim kütle spektrometresi (MS) laboratuvar biz proteinlerin primer dizisini teyit etmek gerekir, mutasyonlar ve sonrası tadilatların varlığını değerlendirmek, proteinlerin bozulması, örnek homojenlik ve izotopik etiketleme kalitesi (örneğin döteryumlu nükleer manyetik rezonans çalışmaları için protein 4). Yapısal biyologlar esnek parçalardan yapısal sert etki ayırt etmek için sınırlı proteolizini kullanabilirsiniz yana, biz güvenilir MS kullanarak bu tür kesik proteinleri karakterize etmek gerekir.

Biomoleküller MS ile analiz edildiğinde, iki olası yaklaşım yumuşak, ağır ve kararsız molekülleri iyonize için kullanılmaktadır. Elektrosprey iyonizasyon (ESI) doğrudan moleküllerini iyonizeSıvı faz, 5, matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI) biyomoleküllerin ultraviyole emici organik moleküller (örneğin, matris moleküller) 6 ile birlikte kristalize gerektirir.

O (ppm ≤ 50) yüksek doğruluk ile kütle kararlılık sağlar, çünkü ESI time-of-flight (TOF) MS sıvı kromatografisi bağlanmış, bozulmamış proteinlerin analizi için rutin bir teknik olmuştur. Bununla birlikte, (tuzları ve deterjanlara, özellikle) numune tampon bileşimine ve analit sinyalinin bastırılması neden bazen ortadan kaldırmak zordur kirletici maddelerin (örneğin, polimerler) oldukça hassastır.

MALDI-TOF MS performansı daha az tampon bileşenleri, deterjan ve kirletici maddeler ile etkilenir, çünkü ESI-MS için etkili bir alternatif temsil eder, ve sekans doğrulama için (500 ppm ≤) yeterli bir hassasiyetle sağlam protein kütle belirlenmesini sağlar. Protei sonran sindirim, MALDI-TOF MS da adlandırılan "peptit kütle parmak izi" ile, bundan başka, primer sekans teyidi için elde edilen peptidleri analiz etmek için kullanılabilir.

Elimizde olanlar, 100 kDa'dan daha büyük ve (nedeniyle, modifikasyon veya kesikler için) heterojen sağlam proteinler, kütle tayini, ESI-MS ile daha MALDI-MS ile daha kolaydır. Bu ESI spektrumları mevcuttur örtüşen şarj durumu dağıtımların eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Ayrıca, MALDI işlem analit boyutu 7, bu tür bir yöntem, yüksek verimler duyarlılık bağlı olmadığı bir biyomolekül kütle 100 kDa'lık üzerinde olduğunda. Sağlam proteinler Olağanüstü analizleri 1980'li yılların sonu ve 1990'lı 8-11 başlangıcı arasında ev yapımı enstrümanları kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Bu numune hazırlama için daha az zaman gerektirir ve interferon karşı daha az hassas olduğu için MALDI-TOF, protein numunelerinin kalitesini değerlendirmek için bir tarama aracı olarak kullanılabilirOrtak yabancı madde (örneğin, tuzlar) nedeniyle ces. MALDI-MS ile bir birinci, hızlı değerlendirme sonra, numune daha yüksek bir doğruluk ile kendi kütlesinin belirlenmesi için ESI-TOF ile analiz edilebilir. Ayrıca, MALDI ESI daha az masraf içeren iyon üretir ve bu nedenle daha basit MALDI veri olduğunu edinme ve yorumlama. Bu yapısal biyoloji çalışan öğrenciler, sadece kısa bir eğitimden sonra kendi rekombinant proteinleri analiz etmeyi sağlar.

Matris ve matris birikimi (örneğin, kurutuldu damlacık 8 ve ince tabaka 12-16,17,18) için yaygın olarak kullanılan teknik: Two önemli faktörler MALDI spektrumları kalitesini etkiler. Tek bir organik matris [örn sinapinik asit (SA), 19-21 ya da α-siyano-4-hidroksisinamik asit (α-CHCA) 14,22,23] genellikle sağlam proteinler ve çapraz bağlanmış protein komplekslerinin MS incelenmesi için kullanılır . Α-CHCA kullanarak, Chait grup daha önce p için ayrıntılı bir protokol sunduönce eriyebilir ve membran proteinlerinin 14,15 MALDI analizine ultra ince bir tabaka reparing. Son zamanlarda, Gorka et al. Matris 24 ile α-CHCA kullanılarak peptidlerin ve proteinlerin analizi MALDI geliştirmek için grafit bazlı hedef kaplama gösterilen.

2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) ve α-CHCA 25: Burada, iki matris bir karışımının kullanılması ile, MALDI-TOF MS ile sağlam proteinlerin analizi için bir protokol mevcut. Sistematik olarak sağlam proteinlerin kontrolü için, SA ve α-CHCA matrisleri ile karşılaştırıldığında DHB-CHCA karışımı performansını değerlendirildi. Matris karışımı daha iyi bir çözünürlük (protein zirveleri çok daha nettir yani) sağlar. Ayrıca, birden fazla yoğun ücretleri iyonların varlığı (örneğin, M +2 H 2 +, M +3 H 3 +, vb) eksenel MALDI-TOF araçların çözünürlüğü ücret üzerinden daha düşük kütle daha yüksek olduğu için (daha doğru bir kütle belirlenmesini sağlarm / z) 26. Bu, 100 kDa'dan daha büyük proteinlerin molekül ağırlığının belirlenmesi için özellikle yararlıdır.

Yüksek hassasiyet de DHB-CHCA karışımı (MALDI hedef üzerinde lekeli protein 0.5 pmol) kullanılarak ulaşılır.

Yukarıda belirtildiği gibi, alet kullanılarak MALDI dikkat edilmesi gereken önemli bir faktördür matris birikmesidir. Laugesen et al. Kurutuldu damlacık birikmesini kullanarak, ilk kez için 25 DHB-CHCA karışımının kullanımını önermiştir. Biz ilk tabaka, aseton içinde çözülmüş α-CHCA ile oluşturulur, ince tabaka yöntem kullanılmıştır, ancak, daha iyi sonuçlar (örneğin, daha yüksek hassasiyet) görülmektedir. İnce tabaka bir yöntem, daha önce 12,27, 15, bir video Jüpiter tanımlanmıştır MALDI hedef üzerinde matris kristaller homojen bir alt tabaka oluşmasını ifade eder. Daha sonra, numune son olarak, bu alt tabaka üzerine bırakılır, veEk matris (aşağıya bakınız) yatırılır. Bu makalede, aynı zamanda MALDI hedef örnek yatırmak için nasıl göstermek değil, aynı zamanda hedef 15 temizlemek için nasıl yeniden kristalize etmek ve matrisler hazırlar.

Hepimiz (özellikle, yapısal biyologlar) bilim adamları, dokunulmamış proteinleri analiz için gerekli bilgileri hızlı ve basit bir şekilde üretilen proteinlerin kalitesini değerlendirmek gerekiyor ve kim sağlamayı hedefliyoruz sonuçlandırmak için MALDI-TOF MS ile çok aşina değil. 1990'ların 28 olarak tahmin, MS biyologlar onun erişilebilirlik artmış gibi, biyolojik araştırma üzerinde artan bir etkisi oldu. Biz sağlanan bilgilerin kütle spektrometresi kullanarak başlamak istiyorum biyolog ve bilim adamlarına MALDI-TOF erişilebilir yapmak için yararlı olacağını umuyoruz.

Protocol

1.. Protein Numune Hazırlama: Tampon Borsası (İsteğe bağlı) Protein (1-20 uM) ve mikromolar konsantrasyonlar 5-25 ul gereklidir. Tampon değişimi, santrifüj, ultrafiltrasyon cihazları (örneğin Vivaspin, Sartorius) ya da mikro santrifüj jel süzme sütunu (örneğin, Mikro Bio-Spin 6 kromatografi sütun, Bio-Rad) 29,30 kullanılarak gerçekleştirilebilir. Tampon değişimi adımlar 2-3x tekrar edilebilir. Tampon değişimi ayrıntılı açıklaması, daha önce 29,30 sunuldu. Örneğin, 20 mM tris nihai tampon (hidroksimetil) aminometan (örneğin Tris) pH 8 kullanmaktadır. Not: Bu adım birçok durumda, iptal de edilebilir. Bir protein örneği güçlü MS tespiti engelleyebilir molekülleri veya tamponları içeren zaman yapılmalıdır [örneğin gliserol, 4 – (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit, HEPES]. Bu qu geliştirmek için de faydalıdırspektrumlarının ality. 2. Matris kristalleştirilmelerinden Onların Saflık (İsteğe bağlı) Geliştirmek Üzere Bir Pyrex şişeye% 40 etanol (EtOH) 10 ml dökün. Bir matrisin 600 mg ekleyin. , Bir su banyosu ve bir direnç ısıtıcı kullanarak, matris çözeltisi sıcak ve matris tamamen bir cam çubuk ya da manyetik bir karıştırıcı kullanılarak çözülür kadar karıştırın. Eğer doymuş bir çözüm bulana kadar 2. adımı tekrarlayın. Not: çözücünün bir çok büyük hacimli ya da uzak çözeltinin kaynama noktasının altında matris tüm kristaller veya kristallerin zayıf verim neden olur çözülmesi. Çözelti yavaşça soğumaya bırakın. Bir gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta daha sonra birkaç saat boyunca oda sıcaklığında bırakın edebilir. Not: kristaller oluşmadığı takdirde, kristalizasyon, bir cam karıştırma çubuğu ile (sadece çözelti yüzeyinin altında) beherin içine kazınarak indüklenebilir. Süzme ile matris kristalleri toplayın. Buz soğukluğundaki bir çözücü minimum miktarı ile kristaller durulayıp süzün. Kristalleri kurumasını bekleyin. Bu adım için vakum kullanabilirsiniz. 3. MALDI Paslanmaz Çelik Hedef temizliği Metanol (MeOH) ile MALDI plaka durulayın ve özel laboratuvar uygulamaları (örn. Kimwipe'dan) için yapılan bir temizleme beziyle hafifçe silin. H 2 O ile hedef durulayın ve bir temizleme beziyle silin. Bir 600 ml çanak içinde plaka MALDI takın ve% 50 EtOH ile örtün. Ultrasonik bir banyo içinde 10 dakika için EtOH çözelti içindeki hedef sonikasyon. Plaka üzerinde kalan artıkları varsa, bir kez daha 1-4 adımları tekrarlayın. Son olarak, (ya da su ile aşağıdaki nota bakın) MeOH ile hedef durulayın, tüm sıvı bir temizleme doku üzerinde toplanan bir şekilde eğin. Oda sıcaklığında veya kullanılarak azot-de hedef kurumasını bekleyingaz akışı. Not: Benzer bir prosedür daha önce 15 nitelendirildi. Not: hedef son durulanması için kullanılan çözücü (MeOH veya su) bir hedef özellikleri belirler. Hedef MeOH ile durulanır, numune su kullanırken çok daha fazla hedefe yayılır. 4. α-CHCA İnce Tabaka Çözüm: MALDI Hedef Hazırlama ve Biriktirme Doymuş bir çözelti elde etmek için aseton içinde α-CHCA çözülür. El ile (bir pipetle olmadan) α-CHCA doymuş çözelti içinde 10 ul ucu (örneğin GELoader Tip, Eppendorf) daldırma: Çözeltinin küçük bir miktarı (nedeniyle kılcallık) uç akacaktır. Pipet ile çok hızlı bir şekilde (yani 1 sn) MALDI hedefe dokunun ve MALDI hedef α-CHCA aseton çözüm yatırmak. Bu matris ince bir tabaka, protein oluşturacakörnek yatırılacaktır. Mümkün olduğunca küçük bir ince tabaka nokta oluşturmak için deneyin. Not: matris olarak SA kullanırken, aseton içinde SA doymuş bir çözeltisi kullanılarak ince bir tabaka hazırlanır. 5. SA, α-CHCA, DHB ve CHCA_DHB Karışım 25: Natrix Solutions hazırlanması , ACN içinde% 0.1 TFA (70:30, hac / hac), 20 mg / ml SA çözelti hazırlayın. ACN içinde 20 mg / ml α-CHCA çözeltisi ve% 5 formik asit ["α-CHCA solüsyon" olarak adlandırılan] (70:30, hac / hac) hazırlayın. Bir ACN içinde 20 mg / ml çözelti ve DHB ["DHB solüsyon" olarak adlandırılan]% 0.1 trifloroasetik asit (TFA) (70:30, hac / hac) hazırlayın. "CHCA_DHB çözüm" elde etmek, 01:01 oranında (hacim / hacim) içinde "α-CHCA çözüm" ve "DHB çözüm" karıştırın. Not: Kütle az 100 kDa olan proteinleri analiz ederken biri de, farklı oranlarda "α-CHCA çözüm" ve "DHB çözüm" karıştırabilirsiniz. EXA içinmple α-CHCA ve DHB (hacim / hacim) arasında 40:60 'lık bir oranı, daha iyi bir çözünürlük daha az duyarlılık (tartışmaya bakınız) elde edilir. 6. MALDI Hedef üzerinde örnek Biriktirme Önceden hazırlanmış α-CHCA ince bir tabaka üzerinde protein örneğinin Deposit 0.5 ul. Hemen bundan sonra, matris solüsyonu (örneğin, SA çözelti ya da α-CHCA çözelti ya da "CHCA_DHB mix"), 0.5 ul ekleyin. Bu durum, hedef numune ve karıştırma matrisi ifade eder. Not: Genellikle bir 1:1 oranında matris ile protein örnek karıştırır. Bu oran MALDI spektrumlarının kaliteli için çok önemlidir. Farklı örnek konsantrasyonları test etmek isterseniz, size örnek sulandırmak için ACN_formic asit çözeltisi (yukarıda açıklanan) kullanabilirsiniz. Not: Eğer tercih ederseniz, bir tüpün içinde örnek ve matris karıştırın ve daha sonra karışık "sample_matrix çözüm yatırabilirsinizince bir tabaka ile ilgili bilgiler de ". Not: Biz örnek seyreltilmesi size kirleticilerin paraziti azaltmak için izin verir, çünkü farklı örnek konsantrasyonları test öneririz. Numunesinin seyreltilmesi için, numunenin seyreltilmesi ACN_formic asit çözeltisi (yukarıda tarif edilen) kullanabilir. 7. Kalibrant Biriktirme Mevduat kalibrant standardının 0.5 ul (örneğin "standart protein II", Bruker Daltonics, Bremen) sonra matris solüsyon 0.5 ul ekleyin. Not: Protein örnek noktalar yanında MALDI plakasının (tartışma) hakkında kalibrant yükleyin. 8. Kalibrant MALDI Spectra kazanılması ve Protein Örnekleri Örnekler ve kalibrant kurutulur sonra, mikroskop altında "noktalar" gözlemleyebilirsiniz. Bu gözlem, isteğe bağlıdır ve acemiler için özellikle ilginç olabilir. Örnek spektrumları elde etmek için, inci eklemeke MALDI-TOF aracı hedef ve ekipman her tür için farklı uygun enstrümantal parametreleri seçin. En uygun set-up almak için tek üretici önerileri takip etmeli. Sağlam proteinlerin analiz Genelde hususlar olarak, bir (analizleri peptidler için uygun değildir reflektör modunda), doğrusal modda aracı kullanmak gerekir. Normalde biz pozitif iyon modunda bizim aleti kullanmaktadır. Ayrıca, önemli bir parametre etkili çözünürlüğünü artırır 31 "pulsed iyon çıkarma" dir. Basitçe, "pulsed iyon çıkarma" örnek iyonlarının oluşturulması ve iyonlar, detektör doğru hızlandırılır ve zaman arasında bir duraklama olarak tanımlanabilir. Dokunulmamış proteinleri analiz ederken, bir peptid gözlem zaman daha büyük bir "atımlı iyon çıkarma" (örneğin 500 nsn) ile nano kullanılabilir (örneğin 80 nsn) ile nano. Olmalıdır Uygun m / z aralığı seçin, spektrumları o kazanırf kalibrant ve aleti kalibre edin. Eğer örneklerin spektrumları elde zaman, uygun lazer yoğunluğunu (tartışma) kullanın.

Representative Results

Iki farklı matrisler, iki çökeltme yöntemleri ve aynı lazer yoğunluk (Şekil 1) kullanılarak,:, biz dokunulmamış protein (123.386 Da molekül ağırlığı kromozom bölgesi bakım 1 protein, Crm1) analiz edilmiştir. SA ve CHCA_DHB karışım matrisleri gibi kullanılmıştır. Karışım (Şekil 1A ve B) gürültü oranı sinyal-ve hassasiyet açısından yüksek kalitede kütle spektrumları elde edilmiştir. Özellikle, MALDI hedef (Şekil 1C) üzerinde biriken protein, 0.5 pmol saptayabildi. Proteinin aynı miktarda SA (Şekil 1D) kullanılarak sonrasında ancak dedekte edilebilmiştir. Ayrıca, matrisler karışımı kullanılarak, matris depozisyonu için tercih edilen bir yöntem olup, "ince tabaka" yaklaşımı (Şekil 1A) idi. "Kuru damla" yöntemi kullanarak, daha yüksek bir kütle 100 kDa (veriler gösterilmemiştir) sahip herhangi bir proteinin tespit etmedi. CHCA_DHB karışımı (Şekil 1A ve 1C) kullanarak, çarpma Protei iyon ücretn eksenel MALDI-TOF araçlar tepe çözünürlük, m / z 26 ile ters orantılı olduğundan, daha yüksek bir doğruluk ile kütle kararlılık sağlayan gözlenmiştir. Ayrıca monomerik beta-galaktosidaz (116.300 Da) (Şekil 2) ile analiz edilir. CHCA_DHB spektrumları hassasiyet ve çözünürlük açısından SA spektrumları daha iyi idi. Ayrıca, çok yüklü iyonların (M + 2, 3 M + ve M + 4) varlığının bize daha yüksek doğrulukla, proteinin kütlesini (Şekil 2A ve 2C) onaylamak için bırakıldı. Ince tabaka yaklaşımı kullanarak, bir immünoglobulinin, IgG analizi (148.500 Da) (Şekil 3) için CHCA_DHB karışım, SA ve tek başına α-CHCA performansını karşılaştırıldı. Biz farklı verileri ilişkili olduğunda, protein sinyalleri yüksekti ve CHCA_DHB spektrumları daha iyi çözünürlüğe sahip. Sonuç olarak, karışım CHCA_DHB ve ince tabaka yerleştirme yönteminin kullanılması bir MALDI TOF aleti kullanılarak elde edilen çok sağlam protein kütle spektrumlarının kalitesinde önemli gelişmeler göstermiştir. Şekil 1. 123.386 Da: dokunulmamış Kromozom bölgesi bakım 1 proteini, (Crm1), molekül ağırlığı, MALDI-TOF analizi. . Crm1 A) 1 pmole matris B) miktarı olarak DHB_CHCA karışımı kullanılarak analiz edildi: 1 pmole; matris:. SA C) miktarı: 0.5 pmol; matris:. DHB_CHCA D) miktarı: 0.5 pmol; matris: SA. Tepe sinyal, keyfi bir ölçek birim yoğunluk olarak ifade edilmiştir, her bir spektrum içinde en yüksek değer mevcut normalize edilir. pg "src =" / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg "/> Şekil 2. Sağlam beta-galaktosidaz (116.300 Da) MALDI-TOF analizi. A) miktarı: 20 pmol; matris DHB_CHCA B) miktarı:. 20 pmol; matris:. SA C) miktarı: 5 pmol; matris:. DHB_CHCA D) miktarı: 5 pmol; matrisi: SA. Şekil 3,. Bozulmamış bir immünoglobülin, IgG (148.500 Da) MALDI-TOF analizi, miktarı:. 1.7 pmol spektrumları CHCA_DHB karışımı ile elde edilen çok daha yoğun olan (maksimum: 8200 keyfi birim, au) SA spektrumları fazla (en fazla 1.200 au) ve α-CHCA spektrumları (maksimum: 4500 au)

Discussion

Biz, bir MALDI-TOF cihazı kullanılarak, 100 kDa'dan daha büyük molekül ağırlıklarına sahip olan çok sağlam proteinlerin yüksek kaliteli kütle spektrumu elde etmek için bir ayrıntılı protokol sundu. Numune hazırlanmasına ilişkin kritik yönleri bir dizi dikkatle kütle spektrumları kalitesini artırmak amacıyla dikkate alınmalıdır. Matrisler ve çözücüler içinde mevcut tüm kirleticileri çözücü buharlaştırma sonra MALDI hedef üzerinde konsantre edilir, çünkü Matrisler ve yüksek saflıkta, çözücüler, kritik bir önem taşımaktadır. MALDI matrislerin saflığını arttırmak için (yukarıda bakınız) klasik tekrar kristalleştirme yöntemleri kullanarak bunları arındırmak mümkündür. Biz de taze matris kristalleşmesi iyileştirecek ve matris bozulmasını önlemek için (en azından haftada bir kez) matrisler çözümlerin hazırlanması için tavsiye.

Matris yerleştirme yaklaşım spektrumlarının nihai kalitesi için çok önemlidir. Yukarıda tarif edildiği gibi, ince tabaka yöntem eden yöntem o olduğunuf seçim 12. Ayrıca, biz ilk tabakasının bırakılması için optimize edilmiş bir yaklaşım. Matris doymuş bir çözelti elde etmek için aseton içinde çözülür, propanon çözücünün hızla buharlaşmasına izin verir, fakat aynı zamanda kontrol etmek için birinci tabakanın boyutu çok zor hale getirir. Size hızlı bir şekilde hedefe yatırmak minimum hacim elde matrix_acetone çözüm daldırma küçük fırça gibi bir GELoader ucu kullanmanızı öneririz. Birinci tabakanın büyüklüğü şekilde MALDI nokta nihai boyutunu kontrol eder Bu durumda, numune konsantrasyonu geniş bir nokta durumunda daha yüksek olduğu için, küçük bir nokta (çapı örneğin 0.5-0.75 mm) tercih edilir. Küçük bir nokta elde etme önce bir JOVE videoda 15 önerilen ultra-ince tabaka yaklaşımı farklıdır. Fenyo ve ark. Ince tabaka çözelti, her bir pipet ucu yan kullanılarak MALDI hedef üzerinde yayılır. Bu yaklaşım, belirli kriterlere uygun olmalıdır ince bir tabaka test gerektirir(Çözücü buharlaşma örneğin hız). Kriteri karşılanmazsa, MALDI hedef yıkanmalı ve yeni bir ince tabaka hazırlanmalıdır. Bu, bir acemi için hazırlık oldukça zahmetli hale getirir. Ayrıca, plaka üzerinde örnek / matris karışımının çökelmesi Fenyo ve diğerleri. Müstahzar eden bir yaklaşım biraz daha zor hale, bir vakum hattı ve 15 TFA kullanarak bir yıkama aşaması kullanılarak fazla solventin ortadan aspirasyon gereklidir gerektirir.

Matrisin ve örnek arasındaki hacim oranı MALDI-TOF ile sağlam proteinlerin bir başarılı bir analizi için oldukça önemlidir. Farklı oranlarını test sonra 1:1 oranı kullanmanızı öneririm. Farklı bir matris: örnek oranı nedeniyle muhtemelen homojen olmayan kristalinizasyona spektrumlarının kalitesini tehlikeye atabilir. Matris ve örnek tevdi edildiği sırası da önemlidir. Matris ince bir tabaka yatırma sonra, numune yatırılır ve hemen SAMP önce (sonrale spot) kuru olur CHCA_DHB karışımı ilave edilir. Bu işlem, tek başına iki örnek matris tabaka arasında yatırılır "sandviç yöntemi" 27 olarak ifade edilmiştir. Bir alternatif olarak, CHCA_DHB çözeltisi ve örnek 0.5 ml bir tüp içinde karıştırılabilir ve daha sonra ince bir tabaka CHCA 12 gördü. Bu, yüksek kalite spektrumlarında edilen kristallerin homojen tabakası ile bir nokta üretmektedir. Bu keskin tepe üretebilir, ancak ölçüm hassasiyeti (daha az şiddetli pikler) tehlikeye;: a kütle daha düşük 100 kDa, DHB 'nin konsantrasyonu ile proteinlerin analiz ederken (örn. 60:40 CHCA DHB) artırılabilir.

Doğru alet kalibrasyonu için, daha iyi bir kitle doğruluğu elde etmek için izin, örnek noktalar çok yakındır kalibrant standartlarını yatırmak gereklidir. Bir "sözde dahili kalibrasyon prosedürü" Daha önce 15 önerildi: örnek bir spektrum, kalibrant nokta i kazanılmasından sonrakalibran s lazer atış ve sinyal örnek spektrum eklenir. Bu dahili kalibrant doruklarına kullanarak örnek spektrumu kalibre sağlar.

Lazer enerjisi de dikkatle spektrumları elde edilmesi sırasında kontrol edilmelidir. Çoğu durumda, daha yüksek enerji duyarlılığını artırır ancak çözünürlüğü düşürür. Biz satın alma hassasiyeti ödün vermeden mümkün olan minimum lazer enerjisini kullanmanızı öneririz. Ayrıca, spektral kalitesini artırmak için, birer numune noktada daha fazla çekim edinebilirler. Normal olarak, daha fazla çekim size (1,000-2,000 çekim) kazanmak, sinyalin yoğunluğu artar. Lazer ile nokta isabet zaman, bir numune homojen olarak dağılmış olmadığından, doğru pozisyonda (yani "sweet spot") bulmak gerekiyor. Sen sinyal arttıkça kadar aynı alanda ateş, ve sonra numuneyi içeren başka bir alan bulmak için deneyebilirsiniz.

Matris ve SOLV bir sonuç, yüksek saflıktaveliler, örnek ve hedef matris birikimi için kullanılan yöntemler, kalibrasyon, lazer enerjisinin şiddeti, satın alma zamanında (çekim / nokta sayısı) için kullanılan standartların pozisyon biri dikkate almalıdır kritik faktörlerdir MALDI-TOF MS ile analiz sağlam proteinler.

Yazar Katılımlar

LS ve EBE, deneyler tasarlanmış kütle spektrometresi deneyler, verileri analiz ve el yazması yazdı.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz yazının eleştirel değerlendirilmesi ve yararlı tartışmalar için, IBS Dr Christophe Masselon (iRTV, CEA, Grenoble) ve Viral Enfeksiyon üyeleri ve Kanser Grubu teşekkür ederim. Biz proteinin Crm1 tür hediye Cyril Dian minnettarız. Bu bilimsel çalışma Grenoble talimat Merkezi'nin (; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL'de ISBG) ve kütle spektrometresi tesis yer aldı. Bu mali Entegre Yapısal Biyoloji Girişimi (FRISBI, ANR-10-InSb-05-02) için Fransız Altyapı tarafından desteklenen, GRAL (ANR-10-LabX-49-01) [Grenoble Ortaklığı bünyesinde Yapısal Biyoloji] ve Bilimsel Araştırma için Fransız Ulusal Merkezi (CNRS).

Materials

      REAGENTS
Trizma hydrochloride Sigma T3253  
Trizima Sigma T6066  
Micro Bio-Spin 6 chromatography columns Bio-Rad 732-6221  
Vivaspin 500 Sartorius VS0122 various molecular weight cut off
Methanol Fluka 14262  
Ethanol Fluka 02860  
KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers Kimberly Clark 05511  
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma Aldrich C8982  
Acetone Sigma Aldrich 650501  
2,5-dihydroxybenzoic acid Fluka 39319  
GELoader Tips Eppendorf 0030 001.222  
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998  
Formic acid Fluka 09676  
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 302031  
Protein Standard II Bruker Daltonics 207234 It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine
Immunoglobulin G ABSciex GEN602151  
      [header]
      EQUIPMENT
Water purifier PURELAB Ultra Analytic ELGA LabWater 89204-052  
Autoflex MALDI-TOF instrument Bruker Daltonics    
MALDI-TOF target Bruker Daltonics    
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rupp, B. . Biomolecular Crystallography : Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).
  2. Cohen, S. L., Chait, B. T. Mass spectrometry as a tool for protein crystallography. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 30, 67-85 (2001).
  3. Chait, B. T. Mass spectrometry–a useful tool for the protein X-ray crystallographer and NMR spectroscopist. Structure. 2, 465-467 (1994).
  4. Gans, P., et al. Stereospecific isotopic labeling of methyl groups for NMR spectroscopic studies of high-molecular-weight proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 49, 1958-1962 (2010).
  5. Wilm, M. Principles of electrospray ionization. Molecular & cellular proteomics : MCP. 10, M111 009407 (2011).
  6. Urban, P. L., Amantonico, A., Zenobi, R. Lab-on-a-plate: extending the functionality of MALDI-MS and LDI-MS targets. Mass spectrometry reviews. 30, 435-478 (2011).
  7. De Hoffmann, E., Stroobant, V. . Mass Spectrometry: Principles and Applications. , (2007).
  8. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical chemistry. 60, 2299-2301 (1988).
  9. Spengler, B., Cotter, R. J. Ultraviolet laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins above 100,000 daltons by pulsed ion extraction time-of-flight analysis. Analytical chemistry. 62, 793-796 (1990).
  10. Beavis, R. C., Chait, B. T. High-accuracy molecular mass determination of proteins using matrix-assisted laser desorption mass spectrometry. Analytical chemistry. 62, 1836-1840 (1990).
  11. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical chemistry. 63, 1193A-1203A (1991).
  12. Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption ionization mass-spectrometry of proteins. Methods in enzymology. 270, 519-551 (1996).
  13. Xiang, F., Beavis, R. C. A method to increase contaminant tolerance in protein matrix-assisted laser desorption/ionization by the fabrication of thin protein-doped polycrystalline films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
  14. Cadene, M., Chait, B. T. A robust, detergent-friendly method for mass spectrometric analysis of integral membrane proteins. Analytical chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
  15. Fenyo, D., et al. MALDI sample preparation: the ultra thin layer method. J. Vis. Exp.. (3), e192 (2007).
  16. Gabant, G., Cadene, M. Mass spectrometry of full-length integral membrane proteins to define functionally relevant structural features. Methods. 46, 54-61 (2008).
  17. Hook, P., et al. Long range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. The Journal of biological chemistry. 280, 33045-33054 (2005).
  18. Vorm, O., Roepstorff, P. Peptide sequence information derived by partial acid hydrolysis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Biological mass spectrometry. 23, 734-740 (1994).
  19. Beavis, R. C., Chait, B. T. Cinnamic acid derivatives as matrices for ultraviolet laser desorption mass spectrometry of proteins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 3, 432-435 (1989).
  20. Madler, S., Boeri Erba, ., E, R., Zenobi, MALDI-ToF Mass Spectrometry for Studying Noncovalent Complexes of Biomolecules. Topics in current chemistry. , (2012).
  21. Wortmann, A., Pimenova, T., Alves, S., Zenobi, R. Investigation of the first shot phenomenon in MALDI mass spectrometry of protein complexes. The Analyst. 132, 199-207 (2007).
  22. Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-assisted Laser Desorption Mass Spectrometry. Organic Mass Spectrometry. 27, 156-158 (1992).
  23. Liu, Z., Schey, K. L. Optimization of a MALDI TOF-TOF mass spectrometer for intact protein analysis. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16, 482-490 (2005).
  24. Gorka, J., Bahr, U., Karas, M. Graphite supported preparation (GSP) of alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) for peptides and proteins. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1949-1954 (2012).
  25. Laugesen, S., Roepstorff, P. Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 14, 992-1002 (2003).
  26. Sparkman, D. O. . Mass Spectrometry Desk Reference. , (2000).
  27. Kussmann, M., Roepstorff, P. Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS. Methods Mol Biol. 146, 405-424 (2000).
  28. Wang, R., Chait, B. T. High-accuracy mass measurement as a tool for studying proteins. Current opinion in biotechnology. 5, 77-84 (1994).
  29. Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. J. Vis. Exp. (40), e1954 (2010).
  30. Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nature protocols. 2, 715-726 (2007).
  31. Vestal, M. L., Juhasz, P., Martin, S. A. Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight massspectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9, 1044-1050 (1995).

Tags

MALDI-TOFMass SpectrometryIntact ProteinsProtein AnalysisProtein CharacterizationLarge ProteinsProtein Mass DeterminationSample PreparationMatrixCalibrationLaser EnergyAcquisition Time

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. (79), e50635, doi:10.3791/50635 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image