非接触型誘電泳動によりラベルフリーの単離と細胞の濃縮

1。概要：プロトタイプのcDEPマイクロ流体デバイスを製造フォローは、以前に、シリコンウェハ（ 図2）内に所望のチャネル設計（ 図1）をエッチングするためにフォトレジスト及びディープ反応性イオンエッチング（DRIE）を使用して、手順22を報告した。ウェハからマイクロデバイスの放出を改善するためにテフロン（登録商標）の薄い層を堆積させる。 図1。低周波数の概略連続選別装置。サンプルチャネルが実行されると、左から右へと100μmのノコギリくびれと500μm幅です。流体の電極チャネルの2対はそれぞれ、ソースとシンクの電極を構成し、厚さ20μmのPDMSバリアによって試料流路から分離される。 図2。 fabrのcDEP装置のication工程であって、（a）60秒の場合、UV光を選択的にのcDEP装置の幾何学的形状のマスクパターンを介して露光されたフォトレジストと反応し、（b）はフォトレジストを現像液を用いて除去される。（c）のディープ反応性イオンエッチング（DRIE） 50μmの深特徴をエッチングするために使用され、70°Cでの水酸化テトラメチルアンモニウム（TMAH）によるウェットエッチングを5分間25％側壁の粗さを低減するために使用される。（d）にテフロンコーティングがからデバイスの放出を改善するために添加されウェハ。（e）は PDMSを脱気した後に再使用可能なウエハスタンプ上に注ぎ、100°F（f）は、PDMSがウェハから除去されるで45分間硬化される。 PDMS及び清潔なガラススライドを2分間、空気プラズマに曝され、接合されている。 波及を防ぐために、アルミホイルでウェーハをラップします。約20分間脱ガス、硬化剤とエラストマーの10:1の比で、ポリジメチルシロキサン（PDMS）を混合する、及びウエハ上に注ぐ。スタンプのテフロンコーティングの損傷を回避するために、100℃で45分間加熱する。デバイスを冷却することができます。 冷却後、アルミニウム箔を除去する外科用ブレードを用いてPDMSをトリミングし、管の大きさに適した平滑パンチャーを用いてチャネル入口/出口のアクセス穴パンチ。ここでは1.5mmで平滑パンチャーを使用する。 それぞれの水と石鹸リンス、エタノール、DI水、空気と乾燥を使用して、ガラス顕微鏡スライドを清掃してください。スコッチマジックテープを使用したPDMSデバイスを清掃してください。チャンネルが汚れていないことを確認するために、顕微鏡下で調べる。 2分間、空気プラズマにスライドとPDMSデバイスを公開します。しっかりとスライド装置（ 図3）との間の気泡の形成を回避し、スライドガラスにデバイスのチャネル側を押してください。 図3。 </st栄>（A）、シリコンウェーハスタンプ製作、およびサンプルをそれぞれ緑と赤の食品着色料で満たさ流体電極チャンネル（B）、完成したPDMS-ガラスデバイスの間に、フォトリソグラフィに使用されるマスク。寸法については図1を参照してください。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 2。 DEPバッファ中の細胞懸濁液を準備する 「DEPバッファ」と呼ぶことにする低伝導率を作製（100μS/ cm）で緩衝液（8.5％スクロースの[w / v]で、0.3％グルコースの[w / v]で、0.725パーセントRPMI [重量/容量]） 。16 3×10 6細胞/ mlでDEP緩衝液中で細胞を懸濁する。ここでは、癌末期のマウスの卵巣表面上皮（MOSE-L）細胞が使用されている。 注：トリパンブルー色素排除法により細胞生存率分析は、生存率のわずかな減少を示した5時間後、室温でDEP緩衝液に懸濁し、早期MOSE（MOSE-E）は、細胞の（95.1から91.6パーセント）。これは、生存率のわずかな減少同様の細胞は、長期バッファDEPに格納されるべきでないことを示す、MOSE-L細胞について起こることが予測される。 このような酵素的に活性化カルセインAM、蛍光膜透過性色素を用いて細胞を染色。 染め細胞懸濁液の導電率を測定します。導電率は、約100μS/ cmである必要があります。導電率測定が高すぎると、3×10 6細胞/ mlでDEP緩衝液中に再懸濁し、試料をスピンダウンし、導電率測定を繰り返す。 3。のcDEPマイクロ流体チップのロード 30分間真空下でのマイクロ流体チップを置きます。 一方、マイクロ流体チップが配置される顕微鏡のステージにシリンジポンプからの距離をまたがるようにフレキシブルチューブの部分をカット。ここで、チューブの6インチの長さ必要とされている。注射器の先端を針にフィットチューブ。 チューブの断面積で目標収集されたサンプルボリュームを分割して出口管に必要な長さを推定する。ザ·チューブの長さを必要とするカット。 シリンジ内に細胞懸濁液を描画します。気泡がチューブ又はシリンジ内に配置されていないことを確認してください。 真空からチップを取り外す際に、チャンネルに閉じ込められた空気の泡を避けるために、すぐに出口チューブとプライムサンプルチャネルを挿入します。それはバリアが破裂することなく5ミリリットル/時のほぼ一定の高スループットに耐えられることが観察されているものの、（20ミクロン）の薄い絶縁バリアを破壊を避けるために、プライミング時に優しく、注射器をタップします。 プライム電極チャネルに、迅速に、各流体電極チャネルの1コンセントに空のピペットチップを配置します。ローダミンBを少量含有する200μlのPBSをピペットで穏やかに電極チャネルの反対側の端部に流体を導入するためにタップする。穏やかな圧力を維持するローダミンBを含むPBSまで目に見えて、空のピペットチップの先端を進む。各電極のチャネルに対して繰り返します。ローダミンBのみ蛍光流体の電極チャンネルを視覚化するために使用される。 ピペットチップ貯水池内の気泡形成を避け、ゆっくりと上下にピペッティングすることにより、目に見える気泡を除去ローダミンBとPBSで各ピペットチップリザーバーを満たし、プライミング後に。アウトレットチューブを外し、ターゲットボリュームを収集するために、新鮮な出口チューブ容器を挿入した後、適切に廃棄します。 4。のcDEPチップを用いて細胞の特徴クロスオーバー周波数デジタルカメラ（ 図4）を備えた倒立顕微鏡のステージ上のチップを置きます。 図4。 </stroNG>（A）のcDEP実験のための全体的な実験。のcDEPチップは、倒立顕微鏡の台上に配置されている。カメラは、記録のためにパソコンに画像を送信します。シリンジポンプは、一定の入口流れを維持する。関数発生器は、高電圧増幅器で昇圧し、ワイヤ電極のcDEPによりチップに接続された信号を生成する。オシロスコープは、チップに送られる信号を監視している。（B）のcDEPチップと流体と電子接続の詳細ビュー。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 シリンジポンプにシリンジをマウントし、流体電極チャネル貯水池にワイヤ電極を挿入します。 シリンジポンプとシリンジとの間の良好な接触を確保するためには1ml /時間でを通して流体をポンピング。視覚的に妨げられない細胞のフロー及び気泡または漏れがないことを確実にするために、チャネル長を検査する。レッド0.005ミリリットル/時UCE流量。 注意：1ミリリットル/時の31,35と高いスループットが他の形状のデバイスで実現しています。 安全のために、関数発生器、高電圧アンプ、オシロスコープの電源をオンにし、所望の電圧と周波数を調整することにより、電子機器をテストします。ここで、これらのパラメータは、200 Vおよび20 kHzのです。許容可能なパフォーマンス、電源オフの検証時に。高電圧アンプに電極を接続します。 注：これらの実験に使用される高電圧での電子機器を操作するときに適切な電気安全手順に従ってください。 定常流を達成すると、所望の周波数で所望の電圧を印加する。この実験では、電圧は5〜60 kHzの間の周波数で200 V RMSです。 チャネル内の細胞分布を定量化するためのクロスオーバー周波数を特徴付けるために画像処理技術（ステップ5）を有する細胞応答の記録ビデオファイル。これを行うには、一定の電圧を維持し、体系的に周波数を変える。実験の開始時と終了時と同様に、ランダムに実験ランの間に、任意の電界を印加することなく、細胞の分布をコントロール細胞分布を記録する。 （ここでは5分）監視対象の場所に入口から流入するセルに必要な時間の量を推定する。この時間を待って、新しい周波数を設定した後、それから（ここでは、細胞分布の2分のビデオ）を記録を開始。 5。特徴分析クロスオーバー周波数のための画像処理計算スクリプトを使用して、相対的なy位置を決定するために、フレーム毎のビデオフレームを分析する（z方向は、チャネルの垂直深さであり、y方向はチャネル幅であり、x方向、チャネル長）の各蛍光細胞または粒子のダウンストリーム·チャネル、高誘電泳動力の領域から、x座標が指定されました。相対DISのグラフを作成します。tribution。 コントロール分布の中心線と各電圧と周波数の分布の中心線を比較してください。与えられた電圧と様々な周波数では、中心線がコントロールのy位置と一致するクロスオーバー周波数を決定する。 6。細胞選別または濃縮を行うために実験を変化 3×10 6粒子/ mlの総濃度でDEPバッファ内の所望の混合物を一時停止します。ここでは、この混合物をDEPバッファ内の4ミクロンの蛍光ビーズとMOSE-L細胞である。のcDEP素子を作製するために、前述の手順を実行します。 混合物からの細胞を選別または濃縮するために、前述したように、標的細胞とのバックグラウンド粒子のクロスオーバー周波数を決定する。粒子の二つの集団が反対の（d）にDEP力を受けるように、標的細胞とのバックグラウンド粒子を2クロスオーバー周波数の間の周波数で動作する実験irections。 MOSE-L細胞と4μmのビーズを並べ替えるには、11.90±0.63 kHzを超えるマイクロデバイスを操作してください。最近Salmanzadeh ら 33により報告MOSE-L細胞の第一のクロスオーバー周波数ソートされたサンプルの内容を収集するために、出口開口部にグローブの指を置き、ゆっくりとチューブに引っ張ることで、ターゲットボリュームを集める際に出口チューブを外します。さらなる分析のために貯水池に集め、ターゲットボリュームを注ぐ注：他のサンプル回収方法は、チップへの恒久的な貯蔵器を取り付け、簡単なピペッティングして、サンプルを除去することを含む可能性があります。