Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Elizabeth S. Elvington; Alireza Salmanzadeh; Mark A. Stremler; Rafael V. Davalos

doi:10.3791/50634

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Medicine

Isolamento privo di etichetta e di arricchimento delle cellule attraverso Contactless dielettroforesi

Published: September 03, 2013

doi:

10.3791/50634

Elizabeth S. Elvington¹, Alireza Salmanzadeh^1,2, Mark A. Stremler^1,2, Rafael V. Davalos^1,2

¹School of Biomedical Engineering and Science,Virginia Tech, ²Department of Engineering Science and Mechanics,Virginia Tech

Summary

Contactless dielettroforesi (CDEP) realizza l'ordinamento e l'arricchimento delle particelle attraverso le loro intrinseche proprietà dielettriche. Canali elettrodi fluidici sostituire gli elettrodi metallici tradizionali per DEP, adattandosi CDEP per non danneggiare la caratterizzazione sterile e smistamento delle particelle biologiche. Dimostriamo come preparare un Microdevice CDEP e condurre la caratterizzazione delle cellule e sperimentazioni di ordinamento.

Abstract

Dielettroforesi (DEP) è il fenomeno per cui polarizzati particelle in un campo elettrico non uniforme subiscono traslazione, e può essere usato per dirigere il movimento di microparticelle in un marcatore indipendente maniera superficie. Tradizionalmente, i dispositivi DEP includono elettrodi metallici planari fantasia nel canale del campione. Questo approccio può essere costoso e richiede ambienti sterili specializzato. Recentemente, è stato sviluppato un approccio senza contatto chiamato dielettroforesi contactless (CDEP). Questo metodo utilizza il principio classico della DEP evitando il contatto diretto tra elettrodi e campione patterning elettrodi fluidici e un canale di esempio da un'unica polidimetilsilossano (PDMS) substrato, e ha un'applicazione come strategia microfluidica rapido progettata per ordinare e arricchire microparticelle. Unico a questo metodo è che il campo elettrico viene generato tramite canali elettrodi fluidici contenenti un fluido altamente conduttivo, che sono separati dalcanale del campione da una barriera isolante sottile. Perché elettrodi metallici non contattare direttamente il campione, l'elettrolisi, l'elettrodo delaminazione, e la contaminazione del campione sono evitati. Inoltre, ciò consente un processo di fabbricazione poco costoso e semplice.

CDEP è quindi particolarmente adatto per la manipolazione di particelle biologiche sensibili. La forza dielettroforetica agisce sulle particelle dipende non solo su gradienti spaziali del campo elettrico generato da disegno personalizzabile della geometria del dispositivo, ma le proprietà biofisiche intrinseche della cella. Come tale, CDEP è una tecnica priva di etichetta che evita a seconda biomarcatori molecolari-superficie espressa che possono essere variamente espresse all'interno di una popolazione, pur consentendo la caratterizzazione, l'arricchimento, e smistamento di bioparticelle.

Qui, dimostriamo le basi di fabbricazione e sperimentazione utilizzando CDEP. Spieghiamo la semplice preparazione di un chip CDEP con litografia sofficetecniche di y. Discutiamo la procedura sperimentale per la caratterizzazione frequenza di incrocio di una particella o cella, la frequenza alla quale la forza dielettroforetica è zero. Infine, dimostriamo l'uso di questa tecnica per l'ordinamento di una miscela di cellule di cancro ovarico e fluorescenti microsfere (sfere).

Introduction

Arricchimento campione biologico e la cernita delle particelle è spesso necessario per successive analisi. ¹ Ad esempio, l'isolamento di cellule rare da fluidi corporei ha importanti applicazioni nella rilevazione del cancro e la medicina individualizzata. ^2,3 Le tecniche di arricchimento più comunemente utilizzate sono fluorescenti cellule attivate (FACS ) ⁴ e magnetici delle cellule attivate ordinamento (MACS), ⁵ che si basano su marcatori di superficie espressi per differenziare le cellule. Altre strategie includono idrodinamico ⁶ o inerziale ^7,8 smistamento, pinzette ottiche, acoustophoresis ^{9, 10} e dielettroforesi. ^11,12 dielettroforesi è il movimento di una particella polarizzata in presenza di un campo elettrico non uniforme. DEP ¹³ è stato usato per una vasta gamma di applicazioni, comprese le cellule ^2,14 smistamento basate sulla vitalità, ¹⁵ caratterizzare le proprietà bioelettriche delle cellule, ¹⁶ e listerata anche con cambiamenti indotti nelle proprietà biofisiche di cellule. ^17,18 tradizionale DEP utilizza elettrodi planari modellata all'interno di un canale microfluidica per applicare una tensione ed indurre una non uniforme campo elettrico. ¹³ Mentre questa è una tecnica potente, sfide possono derivare, ad esempio elettrodo di delaminazione ed elettrolisi. Dielettroforesi base isolante (IDEP) ¹⁹ ha affrontato le sfide di incrostazione, elettrodo delaminazione, e il degrado spaziale del campo dell'elettrodo attraverso patterning strutture isolanti che inducono disuniformità in un campo elettrico DC. IDEP è stato usato per separare selettivamente cellule di batteri vivi e morti, ¹⁹ isolare spore batteriche, ²⁰ e manipolare il DNA, ²¹ tra altre applicazioni. Riscaldamento Joule può essere una sfida perché può verificarsi come risultato delle tensioni continue elevate spesso richiesti. Per migliorare queste sfide, sono state sviluppate senza contatto microdispositivi DEP. ^22-24

<p class = "jove_content"> La tecnica qui presentata utilizza contactless dielettroforesi (CDEP), così chiamata per la mancanza di un contatto diretto tra gli elettrodi metallici e il canale del campione ^22. Unico a questa strategia è la sostituzione di elettrodi metallici con canali elettrodi pieno di liquido con una soluzione altamente conduttivo. Questi elettrodi fluido sono accoppiati capacitivamente attraverso una sottile barriera isolante al canale campione tramite una tensione alternata. Eliminando il contatto del campione con gli elettrodi riduce le questioni connesse con metodi basati-DEP come l'elettrolisi e la formazione di bolle, la contaminazione del campione, e l'elettrodo delaminazione. Come risultato, CDEP è particolarmente utile per i campioni biologici perché supporta la vitalità delle cellule nel campione. Importante, CDEP in grado di mantenere la sterilità del campione. Un chip può essere preparato in una cappa di coltura cellulare e l'esperimento può essere condotto senza richiedere contatto campione di elettrodi metallici o richiede che il campione sia aperta al environment. Un semplice serbatoio può essere fissato alla presa chip per agevolare il recupero del campione sterile. Inoltre, la fabbricazione di elettrodi fluido dallo stesso materiale polimerico biocompatibile (PDMS) come il canale del campione riduce l'alto costo sostenuto con patterning personalizzata di elettrodi metallici, il tempo richiesto per la fabbricazione, e limita la necessità di attrezzature specializzate camera sterile al patterning iniziale del timbro riutilizzabile wafer di silicio.

Movimento di particelle dovute DEP dipende dalle caratteristiche della particella e il mezzo, così come i gradienti spaziali del campo elettrico. Una particella-e dipendente dalla frequenza fattore, chiamato fattore Clausius-Mossotti (CM), assume un valore compreso -0.5 a 1, e determina la direzione della forza DEP. La frequenza con cui il fattore CM è esattamente zero viene chiamata frequenza di crossover. Questo è il punto in cui nessuna forza dielettroforetica è esercitata su una particella e il segno variazioni del fattore CM. A single frequenza di crossover per microsfere solidi inerti si verifica quando il fattore CM cambia da negativo a positivo ²⁵ Per le cellule di mammifero in tampone conducibilità bassa dell'ordine di 0,01 S / m, una prima frequenza di crossover che indica una transizione da NDEP a PDEP esiste vicino a 10. – 100 kHz, ed è influenzato dalle dimensioni, forma, citoscheletro, e proprietà di membrana della cellula. ^26,27 A seconda frequenza di crossover a un passaggio dal PDEP a regime NDEP è dell'ordine di 10 MHz, ed è influenzata dalla rapporto nucleo-citoplasma, citoplasma conducibilità, e reticolo endoplasmatico. forza DEP ²⁷ può essere applicato senza la presenza di flusso di fluido, ma qui si utilizza un fluido che scorre per raggiungere smistamento continuo di particelle sospese. L'influenza combinata della forza dielettroforetica e il Stokes 'forza di trascinamento dettare la traslazione di una particella.

Abbiamo sviluppato sistemi atti ad azionare in due gamme di frequenza. Frequenc Superioredispositivi y (100-600 kHz) hanno operato utilizzando PDEP e smistamento lotto realizzato delle cellule, come le cellule tumorali della prostata avvio (tic), ovarico epiteliale di superficie (MOSE), le cellule murine, MDA-MB-231 cellule del cancro al seno, o vivere THP -1 cellule selettivamente intrappolando cellule di interesse sui posti situati nel canale del campione isolante. ^28-31 di frequenza inferiore (5-100 kHz) dispositivi funzionano continuamente, e quando si opera ad una frequenza alla quale una popolazione sperimenta PDEP mentre i precedenti esperienze di popolazione NDEP, può reindirizzare traiettorie delle particelle per ottenere l'ordinamento. ^32-34 Questi dispositivi a bassa frequenza sono stati utilizzati per ordinare le cellule tumorali da globuli rossi, determinare le variazioni delle proprietà dielettriche di una linea cellulare MOSE progressiva, e per chiarire gli effetti della non- trattamenti sfingolipidi tossici su invertendo le caratteristiche aggressive delle cellule MOSE aggressivi. Inoltre, microdispositivi CDEP possono essere progettati per funzionare ad una maggiore velocità, attualmente fino a 1 ml / hr. ^31,35

Come descritto, la flessibilità e basso costo del processo di fabbricazione permette geometrie dei dispositivi su misura, che permettono la procedura sperimentale presentato sia rilevante per una vasta gamma di applicazioni. L'obiettivo a lungo termine di CDEP è quello di realizzare label-free cell sorting e di arricchimento sul piano clinico, con il recupero del campione per la successiva cultura o la trasformazione. La tecnica qui presentata è un metodo semplice e poco costoso, dalla fabbricazione di sperimentazione, che aumenta l'accessibilità di DEP. Dimostriamo la preparazione di un chip CDEP e il protocollo sperimentale per ottenere caratterizzazione e arricchimento delle cellule tumorali ovariche di microsfere fluorescenti.

Protocol

1. Realizzazione di un prototipo di dispositivo CDEP Microfluidic: Panoramica Seguire le procedure precedentemente riportate 22 utilizzando photoresist e Deep Reactive Ion Etching (DRIE) per incidere il disegno canale desiderato (Figura 1) in un wafer di silicio (Figura 2). Depositare un sottile strato di teflon per migliorare il rilascio del microdispositivo dal wafer. Figura 1. Schematica di un dispositivo di smistamento continuo a bassa frequenza. Le piste canale del campione sinistra a destra e 500 micron di larghezza con costrizioni a dente di sega a 100 micron. Le due coppie di elettrodi canali fluidici compongono gli elettrodi di source e sink, rispettivamente, e sono separati dal canale campione da una spessa barriera 20 pm PDMS. Figura 2. Il Fabrprocesso icazione di un dispositivo CDEP. (a) per 60 sec, luce UV reagisce selettivamente con photoresist esposto tramite un modello di maschera della geometria del dispositivo CDEP. (b) photoresist viene rimosso utilizzando sviluppatore. (c) profonda Reactive Ion Etching (DRIE) è utilizzato per etch 50 micron caratteristiche profonde, e 5 min di attacco umido da idrossido di tetrametilammonio (TMAH) 25% a 70 ° C viene utilizzato per ridurre la rugosità delle pareti laterali. (d) viene aggiunto un rivestimento in teflon per migliorare il rilascio del dispositivo da il wafer. (e) PDMS cola sul riutilizzabile wafer timbro dopo degasaggio e polimerizzato per 45 min a 100 ° C. (f) PDMS viene rimosso dal wafer. PDMS e un vetrino pulito sono esposti al plasma di aria per 2 min e legati insieme. Avvolgere il wafer con un foglio di alluminio per evitare spill-over. Mescolare polidimetilsilossano (PDMS) in rapporto 10:1 di elastomero per curare agente, de-gas per circa 20 min, E versare sul wafer. Calore per 45 min a 100 ° C per evitare di danneggiare il rivestimento in teflon del timbro. Lasciare che il dispositivo si raffreddi. Dopo raffreddamento, rimuovere un foglio di alluminio, tagliare PDMS utilizzando una lama chirurgica, e perforare fori di accesso al canale di ingresso / uscita utilizzando un perforatore smussato adeguata alle dimensioni del tubo. Qui, viene utilizzato un perforatore smussato e 1,5 mm. Pulire un vetrino per microscopio con un risciacquo di acqua e sapone, etanolo, acqua deionizzata, e asciugatura con aria rispettivamente. Pulire il dispositivo PDMS con del nastro Scotch Magia. Esaminare al microscopio per essere sicuri che i canali siano puliti. Esporre il vetrino e il dispositivo PDMS di plasma ad aria per 2 min. Premere con forza lato canale del dispositivo per vetrino, evitando la formazione di bolle d'aria tra il dispositivo e la slitta (Figura 3). Figura 3. </strong> (a) La maschera utilizzata per fotolitografia durante il timbro fabbricazione di wafer di silicio, e (b) il dispositivo PDMS vetro finito con il campione e canali elettrodi fluido riempito con verde e rosso colorante alimentare, rispettivamente. Vedere la Figura 1 per le dimensioni. Clicca qui per ingrandire la figura . 2. Preparare una sospensione di cellule in DEP Buffer Preparare una bassa conducibilità (100 mS / cm) tampone, che verrà indicato come "tampone DEP" (8,5% di saccarosio [w / v], 0,3% di glucosio [w / v], 0,725% RPMI [w / v]) 16. Sospendere le cellule in tampone DEP a 3 x 10 6 cellule / ml. Qui, vengono utilizzati cancerose del mouse fase tardo-ovarico epiteliale di superficie (MOSE-L) cellule. Nota: analisi vitalità cellulare mediante il metodo esclusione del colorante blu tripano mostrato una lieve diminuzione della redditività(95,1-91,6%), della fase iniziale MOSE (MOSE-E) le cellule sospese in tampone DEP a temperatura ambiente dopo 5 ore. Si prevede che una simile lieve diminuzione della redditività avviene per le cellule MOSE-L, indicando che le cellule non devono essere conservati in DEP tampone lungo termine. Tingere cellule utilizzando un colorante fluorescente membrana permeabile, come il enzimaticamente attivato calceina AM. Misurare la conducibilità della sospensione cellulare tinto. La conducibilità dovrebbe essere di circa 100 mS / cm. Se la misura della conducibilità è troppo alto, ruotare il campione verso il basso, risospendere in tampone DEP a 3 x 10 6 cellule / ml e ripetere la misura di conducibilità. 3. Caricamento della CDEP Microfluidic Chip Posizionare il chip microfluidica sotto vuoto per 30 min. Nel frattempo, tagliare un pezzo di tubo flessibile per coprire la distanza dalla pompa siringa alla fase microscopio in cui verrà collocato il chip microfluidica. Qui, una lunghezza di 6 pollici tuboè richiesto. Adatta tubo alla punta dell'ago sulla siringa. Stimare la lunghezza necessaria per tubo di uscita dividendo il volume del campione raccolto bersaglio per l'area della sezione trasversale del tubo. Tagliare la richiedono lunghezza del tubo. Disegnare sospensione cellulare nella siringa. Controllare che nessuna bolla si trovano nella tubazione o siringa. Dopo la rimozione di chip dal vuoto, inserire il tubo di uscita e primo canale del campione in fretta per evitare bolle d'aria intrappolate nei canali. Battere delicatamente la siringa quando adescamento per evitare la rottura della sottile (20 micron) barriera isolante, anche se è stato osservato che la barriera in grado di sopportare una costante elevato throughput vicino 5 ml / h senza rompersi. Per primi i canali elettrodi, collocare rapidamente le punte delle pipette vuote in una presa di corrente di ciascun canale elettrodo fluido. Pipettare 200 microlitri di PBS contenente una piccola quantità di rodamina B e toccare delicatamente per introdurre il fluido nell'estremità opposta del canale elettrodo. Mantenere una leggera pressionefino PBS con rodamina B progredisce visibilmente la punta della punta della pipetta vuoto. Ripetere per ogni canale elettrodo. Rodamina B è utilizzato solo per visualizzare fluorescente canali elettrodi fluidici. Dopo l'adescamento, riempire ogni serbatoio punta della pipetta con PBS con rodamina B. Evitare la formazione di bolle nei serbatoi punta pipetta e rimuovere eventuali bolle visibili pipettando delicatamente su e giù. Staccare il tubo di uscita ed eliminare in modo appropriato, quindi inserire un nuovo serbatoio tubo di uscita per raccogliere il volume di destinazione. 4. Caratterizzare Frequenza di crossover di cellule utilizzando CDEP Chip Posizionare il chip sulla scena di un microscopio invertito dotato di fotocamera digitale (Figura 4). Figura 4. </strong> (a) la configurazione generale sperimentale per gli esperimenti CDEP. Il chip CDEP si trova sulla piattaforma del microscopio invertito. Una telecamera invia le immagini al computer per la registrazione. La pompa a siringa mantiene un flusso di ingresso costante. Il generatore di funzione genera un segnale che viene intensificato dall'amplificatore ad alta tensione e collegato al chip CDEP da elettrodi a filo. L'oscilloscopio controlla il segnale inviato al chip. (B) Dettaglio vista del chip CDEP e collegamenti fluidici ed elettronici. Clicca qui per ingrandire la figura . Montare siringa pompa siringa e inserire elettrodi a filo in fluidici serbatoi canali dell'elettrodo. Pompare fluido attraverso a 1 ml / hr per assicurare un buon contatto tra la pompa a siringa e la siringa. Controllare visivamente la lunghezza di canale per assicurare libero flusso delle cellule e l'assenza di bolle o perdite. RossoPortata uce a 0.005 ml / h. Nota: Throughput alto come 1 ml / hr 31,35 è stato raggiunto in dispositivi di altre geometrie. Per motivi di sicurezza, testare l'elettronica da accendere il generatore di funzioni, amplificatore ad alta tensione, e oscilloscopio, e la regolazione di tensione e frequenza desiderata. Ecco questi parametri sono 200 V e 20 kHz. Sulla verifica di prestazioni accettabili, spegnere. Collegare gli elettrodi ad un amplificatore ad alta tensione. Nota: Rispettare le procedure di sicurezza elettrica durante il funzionamento dell'elettronica alle alte tensioni utilizzate per questi esperimenti. Al raggiungimento flusso costante, applicare la tensione desiderata alla frequenza desiderata. In questo esperimento, la tensione è 200 V RMS a frequenze comprese tra 5-60 kHz. File video registrazione della risposta cellulare con tecniche di elaborazione di immagini (step 5) quantificare distribuzione di celle nel canale e per caratterizzare la frequenza di crossover. Per fare questo,mantenere una tensione costante e variare la frequenza sistematicamente. All'inizio e alla fine dell'esperimento, così come in modo casuale tra prove sperimentali, registrare la distribuzione delle cellule di controllo, la distribuzione delle cellule senza applicare alcun campo elettrico. Stimare la quantità di tempo necessario per le cellule di fluire dall'ingresso al luogo sorvegliato (qui, 5 min). Dopo aver impostato una nuova frequenza, attendere questo periodo di tempo, quindi iniziare la registrazione (qui, a 2 min video della distribuzione di celle). 5. Image Processing per la caratterizzazione Frequenza di crossover Utilizzo di uno script di calcolo, analizzare ciascun fotogramma per fotogramma per determinare la y-posizione relativa (dove la direzione z è la profondità verticale del canale, la direzione y è la larghezza del canale, e direzione x è la lunghezza di canale) di ogni cella fluorescenti o particelle in un determinato coordinata x valle della regione di alta forza DEP nel canale. Creare un grafico dei relativi displaycontributo. Confrontare la linea centrale della distribuzione ad ogni tensione e frequenza con la linea centrale della distribuzione controllo. Per una data tensione e frequenze variabili, determinare la frequenza di taglio, in cui la linea centrale corrisponde alla posizione y del controllo. 6. Variando la Esperimento per effettuare una cernita cellulare o arricchimento Sospendere miscela desiderata in tampone DEP in concentrazione totale di 3 x 10 6 particelle / ml. Ecco, questa miscela è cellule MOSE-L con 4 perline micron fluorescenti nel buffer DEP. Eseguire i passaggi descritti in precedenza per preparare un dispositivo CDEP. Per ordinare o arricchire cellule da una miscela, determinare le frequenze di taglio delle cellule bersaglio e le particelle di sfondo come precedentemente descritto. Azionare l'esperimento ad una frequenza tra le due frequenze di taglio delle cellule bersaglio e le particelle di fondo in modo che le due popolazioni di particelle sperimentano forze DEP in fronte directions. Per ordinare le celle MOSE-L e 4 micron perline, azionare il Microdevice sopra 11.90 ± 0.63 kHz. la prima frequenza di crossover di cellule MOSE-L recentemente riportato da Salmanzadeh et al 33. Per raccogliere il contenuto di un campione ordinato, rimuovere il tubo di uscita sulla raccolta volume bersaglio, mettendo un dito guanto sopra l'apertura di uscita e delicatamente tirando sul tubo. Versare il volume bersaglio raccolto in un serbatoio per ulteriori analisi Nota:. Altri metodi di recupero di esempio potrebbero includere associare un serbatoio permanente al chip e la rimozione del campione dalla semplice pipettaggio.

Representative Results

DEP deve osservare qualitativamente nel canale del campione per confermare il dispositivo è in funzione quando il campo elettrico è presente. Un metodo per verificare la presenza di DEP è quello di regolare la frequenza di valori lontana dalla frequenza di crossover dove forte PDEP e NDEP sono previsti (circa> 40 kHz osservare PDEP e <10 kHz osservare NDEP per la maggior parte delle cellule tumorali di mammifero in un buffer con conducibilità di 100 mS / cm). Va notato che le microsfere inerti presentano PDEP sotto della loro frequenza di crossover e NDEP sopra loro frequenza di crossover. Per la funzione geometria dente di sega qui presentato, PDEP dovrebbe essere visto per le cellule alla frequenza di prova più elevata, indicata dal verificarsi di perla concatenamento e focalizzazione delle cellule o particelle alla caratteristica bordo a dente di sega del canale, mentre alla frequenza di prova inferiore, NDEP dovrebbe essere evidente come le cellule sono limitate alla regione più vicina al bordo diritto del canale. A queste basse frequenze, le cellule possono LYSe causa di elettroporazione, in modo che il campione può sembrare che contenga meno cellule, e quelli che sono visibili potrebbero apparire allargata o sfocate se si utilizza un colorante fluorescente enzimaticamente attiva. Verifica delle frequenze alle quali PDEP e NDEP verificano permette la determinazione della frequenza di taglio come descritto nel protocollo. Per le cellule tumorali di mammifero, come MOSE-L usato qui, abbiamo osservato NDEP a 5 kHz (figura 5a) e forte PDEP a 60 kHz (Figura 5b). Cellule MOSE-L aveva un diametro di 17,7 ± 3,3 micron (n = 268 cellule) e le perle hanno un diametro nominale 4 micron. Un'analisi completa delle proprietà dielettriche delle cellule MOSE-L rispetto alle cellule Mosè in precedenti fasi di progressione può essere trovato nel recente lavoro di Salmanzadeh et al 33. Se PDEP e NDEP non si attiene a questi estremi, vari problemi potrebbero essere accadendo. La conducibilità campione può essere troppo alta a causa contaminanti o lisi cellulare. INSUFFICIENTEcampo elettrico nt può essere generato a causa di bolle intrappolate nei canali elettrodi fluido, che impediscono conduzione di corrente alla porzione dei canali confinanti con il canale del campione. Moto vario può essere causato da una bolla intrappolata nella siringa o tubo di ingresso, bolle risultante dal non tenere il dispositivo sotto vuoto per un tempo sufficiente o non riempire rapidamente il dispositivo su rimozione dal vuoto, perdite dovute a delaminazione di PDMS scarsa aderenza con la vetrino, lacrime nella membrana di barriera a causa di forza eccessiva esercitata durante il riempimento dei canali, o portate agli estremi del campo di funzionamento della pompa. Oltre a determinare la frequenza di taglio di celle, questa tecnica può essere utilizzata per ordinare una miscela, illustrata qui da una miscela di cellule MOSE-L e perline. Questo esempio sfrutta la dielettroforesi negativa (NDEP) esibito da 4 micron sfere a frequenze dove le cellule MOSE-L sperimentano dielettroforesi positiva (PDEP). Siamo operated il dispositivo a 200 V RMS e 10 kHz (Fig. 6a) e hanno osservato che sia le cellule e perline sono state mescolate come hanno vissuto NDEP. A 50 kHz abbiamo osservato movimento delle cellule MOSE-L alla sommità del canale, mentre perle sono state limitate alla porzione inferiore del canale, consentendo la separazione della miscela in due componenti (Figura 6b). Figura 5. La posizione delle cellule MOSE-L viene manipolata variando la frequenza del campo elettrico applicato. Le foto sono prese alla funzione dente di sega finale del canale del campione e gli elettrodi fluidici sono situate agli angoli sul lato destro. Sono pieni di PBS contenente rodamina B, che reagisce di visualizzare i canali. (A) le cellule MOSE-L esperienza NDEP a 200 V RMS e 5 kHz. (b) le cellule MOSE-L sperimentano concatenamento di perle e PDEP a 200 V RMS e 60 kHz. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 6. Una miscela di cellule MOSE-L (verde) e 4 micron perline (rosso) fluire attraverso la funzione dente di sega finale nel canale campione di un dispositivo CDEP bassa frequenza. (A) a 200 V e 10 kHz cellule e perline vengono miscelati. Le frecce indicano apparire vagamente cellule che probabilmente sono morti a causa delle condizioni di scarsa frequenza. (B) A 200 V e 50 kHz cellule sperimentano PDEP e si muovono verso il bordo caratteristica del canale, mentre perle di esperienza NDEP e rimangono confinati alla regione più vicina il regolo.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.

Discussion

DEP è una potente tecnica per determinare le proprietà dielettriche delle particelle e dirigere il movimento delle particelle verso l'ordinamento delle applicazioni, di isolamento o di arricchimento. A causa degli effetti deleteri del contatto elettrodo diretto con un campione, altri hanno adottato approcci simili al metodo precedentemente presentato per evitare il contatto. Ad esempio, Bashir et al. Sviluppato dispositivi DEP senza contatto, utilizzando un dispositivo PDMS microfluidica separato dalla stampato elettrodi circuito da un vetrino di vetro sottile, e questa tecnica è anche reso disponibile in formato video. ^23,36

Qui, abbiamo dimostrato la fabbricazione di un chip CDEP elettrodi e fluidici utilizzando un unico substrato PDMS, e il protocollo sperimentale per la separazione di cellule tumorali ovariche da una miscela di cellule e perline fluorescenti. La tecnica presentata è stata utilizzata con successo per una varietà di applicazioni più complesse e fisiologicamente rilevanti, inclusa la cernita livE e cellule morte, ²⁸ tumore avviare cellule da cellule di carcinoma della prostata, ³⁰ cellule tumorali da diluite globuli rossi, ^31,32 e differenziare tra stadi del cancro ³⁷ e cancro ovarico. ²⁹ CDEP stato anche utilizzato per la miscelazione di particelle. ³⁸ Fra applicazioni suggeriscono che utilizzando la tecnica semplice presentato, scopi diversi può essere realizzato semplicemente modificando il disegno della geometria del canale.

. DEP è utile su microscala per la manipolazione di particelle ¹³ per particelle sferiche, la forza dielettroforetica traslazionale dipende dalle proprietà elettriche e dimensioni della particella e il suo mezzo di sospensione, così come il gradiente del campo elettrico quadrato:

dove ε _m è la permittività del mezzo di sospensione, r è il raggiodella particella, e Rc [k (ω)] è la parte reale del fattore di Clausius-Mossotti (CM). Il fattore CM è una misura della relativa polarizzabilità della particella rispetto al mezzo di sospensione e determina la direzione della forza dielettroforetica. È descritto come

dove e sono i complessi permittività della particella e mezzo, rispettivamente. La permettività complessa, , Dipende dalla conducibilità (σ) e frequenza (ω). Il fattore CM di particelle sferiche è teoricamente vincolata tra -0.5 e 1. Se il fattore CM è negativa, le particelle si NDEP perché il mezzo è più polarizzabile di particella, così le particelle si muovono distanti regionielevati gradienti di campo elettrico. Se il fattore CM è positivo, le particelle sono più polarizzabile di medio e sperimentano PDEP in cui si muovono verso regioni di alta gradienti di campo elettrico.

Per particelle biologiche che sono non omogenea nella struttura, come le cellule, il fattore di Clausius-Mossotti può essere determinato da un valore effettivo della permittività particella:

dove e sono la permettività complessa dell'effettiva permettività complessa dell'interno della cellula, come il citoplasma, e la membrana plasmatica, rispettivamente. r è il raggio della cella, e d è lo spessore della membrana plasmatica ²⁶

Quando DEP verifica con particelle sospese in unfluido, il moto della particella relativa al fluido genera una forza di trascinamento sulla particella. Questa forza di resistenza deve essere considerato nel determinare la forza complessiva che agisce sulla particella. Per le situazioni di interesse qui, forze viscose dominano e le particelle sono assunti sferico, piccolo, e si muove con velocità relativamente bassa, quindi trascinare la legge di Stokes 'fornisce una buona approssimazione della forza di trascinamento:

dove η è la viscosità del fluido, _p u è la velocità della particella, e u _f è la velocità del fluido, che può anche essere in movimento. Data la forza dielettroforetica, fluido e le proprietà delle particelle noto, e una velocità di flusso noto, l'equilibrio tra la forza di resistenza e la forza dielettroforetica può essere risolto per stimare la velocità delle particelle. Il gradiente di velocità che l'esperienza celle deve essere inferiore alla soglia alla quale cell lisi può accadere.

Caratterizzazione delle proprietà elettriche delle particelle è necessario prevedere e controllare come risponderà sotto DEP loro. In questo lavoro, in particolare utilizzato i CDEP bassa frequenza con celle MOSE-L per dimostrare il protocollo per la determinazione prima frequenza di crossover delle cellule, e quindi mostrato smistamento continuo di perle di polistirene e cellule MOSE-L in base alle loro risposte DEP opposte.

Alterare la geometria del dispositivo CDEP cambierà i gradienti spaziali del campo elettrico, consentendo ai dispositivi di essere progettati per alta frequenza oa bassa frequenza, e per alta selettività ed efficienza di selezione, per un tipo cellulare specificato. Inoltre, i dispositivi high throughput possono essere sviluppate fabbricando canali più ampi, ³⁰ canali in parallelo, ³⁰ o di fabbricazione multistrato ^35, in cui i canali degli elettrodi sono impilati verticalmente sopra e sotto una relativamente profondacanale del campione. Sottili membrane formano la barriera tra strati. Un saggio preliminare con i dispositivi fabbricati in polimetilmetacrilato (PMMA) e policarbonato (PC) film sottili hanno dimostrato risposta DEP di cellule MOSE-L. Gli attuali sforzi sono in corso per definire dispositivi high-throughput multi-strato e di migliorare il sistema periferico verso un eventuale piattaforma plug-and-play. Per espandere dalla tecnica sperimentale di base presentati, le applicazioni e le specifiche del dispositivo possono essere personalizzati per soddisfare esigenze particolari, come l'ordinamento contro la caratterizzazione, o l'aggiunta di serbatoi campione e un sistema semi-automatico al dispositivo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro sostenuto è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation sotto Grant No. EFRI 0938047, e dal Virginia Tech Institute per la Tecnologia Critica e Scienze Applicate (ICTAS). Gli autori desiderano esprimere apprezzamento al Dr. Eva Schmelz e il Dr. Paul Roberts per la loro gentile dono di cellule MOSE-L. Gli autori riconoscono Angela Anderson per la sua assistenza con la coltura cellulare, Caitlan Swaffar per il suo aiuto con la modifica di questo documento e la preparazione di esperimenti, e tutti i membri del laboratorio Bioelectromechanical Sistemi.

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning, Midland, MI,USA	Sylgard 184
Glass slides	The Microscope Depot	76079	2×3 inch-ground edges
Microbore PTFE Tubing	Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA	EW-06417-31	Thin walled 20 gauge, 0.032″ID x 0.056″OD, 100 ft/roll
Luer-slip plastic syringes	National Scientific company	S7510-1
Needle tip	Howard Electronic instruments	JG20-1.0	20 Gauge 1.0″, ID=0.025″ OD=0.036″
D(+)-Sucrose	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S3-500
D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous	Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ	AC410955000
RPMI-1640 Medium	Quality Biological Inc.	112-025-101
Calcein AM, Molecular Probes	Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA	C3100MP	excitation wavelength 488/emission wavelength 516
Rhodamine B, O	Science Lab	SLR1465-100G	excitation wavelength 540/emission wavelength 625
Phosphate buffered saline (10X)	Gbiosciences, St. Louis, MO	RC-147
Leica, inverted light microscope	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	Leica DMI 6000B
Leica DFC420, color camera	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	Leica DFC420
Function generator	GW Instek, Taipei, Taiwan	GFG-3015
Wideband power amplifier	Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA	AL-50HF-A
HFHV Output Transformer		AL-T50-V25/300-F100K-600K
High voltage amplifier	Trek	Model 2205
USB Modular Oscilloscope, 100 MHz	AgilentTechnologies	U2701A
Expanded Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-001/002 (115/230V)	air plasma
Scotch Magic tape	3M		any available width is sufficient
1.5 mm puncher	Harris Uni-Core	Z708836-25EA
.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
FluoSpheres Sulfate Microspheres	Invitrogen	F8858	4.0 μm, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)
AZ 9260 photoresist	AZ Electronic Materials
AZ 400 K developer	AZ Electronic Materials
Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%			provided by Virginia Tech cleanroom
Teflon coating			applied using DRIE machine
Silicon wafer	University Wafer	452	100 mm diameter, 500 μm thickness, one side polished (SSP)
Deep Reactive Ion Etching (DRIE)	Alcatrel	AMS SDE 100

References

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Elvington, E. S., Salmanzadeh, A., Stremler, M. A., Davalos, R. V. Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis. J. Vis. Exp. (79), e50634, doi:10.3791/50634 (2013).

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