Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Elizabeth S. Elvington; Alireza Salmanzadeh; Mark A. Stremler; Rafael V. Davalos

doi:10.3791/50634

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Medicine

בידוד ללא תווית והעשרה של תאים דרך מגע dielectrophoresis

Published: September 03, 2013

doi:

10.3791/50634

Elizabeth S. Elvington¹, Alireza Salmanzadeh^1,2, Mark A. Stremler^1,2, Rafael V. Davalos^1,2

¹School of Biomedical Engineering and Science,Virginia Tech, ²Department of Engineering Science and Mechanics,Virginia Tech

Summary

dielectrophoresis מגע (cDEP) משיג מיון והעשרה של חלקיקים באמצעות מאפייני דיאלקטרי הפנימיים שלהם. ערוצי האלקטרודה Fluidic להחליף אלקטרודות מתכתיות מסורתיות לDEP, אריג cDEP למים שאינם פוגע באפיון סטרילי ומיון של חלקיקים ביולוגיים. אנו מדגימים כיצד להכין microdevice cDEP ולערוך אפיון תא וניסויים מיון.

Abstract

Dielectrophoresis (DEP) היא התופעה שבה מקוטבת חלקיקים בשדה חשמלי לא אחיד עוברים תנועת translational, והוא יכול לשמש כדי לכוון את התנועה של microparticles באופן סמן בלתי תלוי בשטח. באופן מסורתי, מכשירי DEP כוללים אלקטרודות מתכת מישוריים בדוגמת בערוץ המדגם. גישה זו יכולה להיות יקרה ודורשת סביבת חדר נקי מיוחדת. לאחרונה, גישה ללא קשר נקראת dielectrophoresis מגע (cDEP) פותחה. שיטה זו מנצלת את העיקרון הקלאסי של DEP תוך הימנעות ממגע ישיר בין האלקטרודות ומדגם על ידי אלקטרודות fluidic דפוסים וערוץ מדגם מpolydimethylsiloxane יחידה (PDMS) מצע, ויש לו יישום כאסטרטגיה microfluidic מהירה שנועדה למיין ולהעשיר microparticles. ייחודי לשיטה זו היא שהשדה החשמלי שנוצר דרך ערוצי האלקטרודה fluidic המכילים נוזל מוליך מאוד, אשר מופרדים מערוץ מדגם על ידי מחסום בידוד דק. בגלל אלקטרודות מתכת לא ישירות לפנות למדגם, אלקטרוליזה, delamination אלקטרודה, וזיהום מדגם נמנעים. בנוסף, זה מאפשר תהליך ייצור זול ופשוט.

cDEP לכן מתאים היטב לטיפול בחלקיקים ביולוגיים רגישים. כוח dielectrophoretic פועל על החלקיקים תלויים לא רק על הדרגות המרחבי של השדה החשמלי שנוצר על ידי עיצוב להתאמה אישית של מכשיר הגיאומטריה, אבל מאפייני biophysical הפנימיים של התא. ככזה, cDEP היא טכניקה ללא תווית שמונעת בהתאם לסמנים ביולוגיים מולקולריים הביע משטח שעשוי לבוא לידי ביטוי variably בתוך אוכלוסייה, תוך שהוא מאפשר אפיון, העשרה, ומיון של bioparticles.

הנה, אנחנו מדגימים את העקרונות הבסיסיים של ייצור וניסוי באמצעות cDEP. אנחנו מסבירים את ההכנה הפשוטה של שבב cDEP באמצעות ליטוגרפיה הרכהטכניקות y. אנחנו דנים בהליך ניסיוני לאפיון תדר חיתוך של חלקיק או תא, התדירות שבה כוח dielectrophoretic הוא אפס. לבסוף, אנחנו מדגימים את השימוש בטכניקה זו למיון תערובת של תאי סרטן שחלות וfluorescing זעירים (חרוזים).

Introduction

העשרת מדגם ביולוגית ומיון חלקיקים הוא לעתים קרובות יש צורך לניתוח שלאחר מכן. לדוגמא, בידוד של תאים נדירים מנוזלי גוף יש ¹ יישומים חשובים בגילוי הסרטן ורפואה מותאמת אישית. ^2,3 טכניקות ההעשרה הנפוצה ביותר הן תא ניאון מיון מופעל (FACS ) ⁴ ומגנטיים תא מיון מופעל (MACS), ⁵ אשר מסתמכים על סמני משטח הביעו לבדל את התאים. אסטרטגיות אחרות כוללות הידרודינמית מיון ⁶ או ^7,8 האינרציה, פינצטה אופטית, ⁹ acoustophoresis, ¹⁰ וdielectrophoresis. ^11,12 dielectrophoresis היא התנועה של חלקיקים מקוטבים בנוכחות שדה חשמלי לא אחיד. ¹³ DEP שמש במשך מגוון רחב של יישומים, כוללים תאים ^2,14 מיון המבוססים על כדאיות, ¹⁵ אפיון תכונות bioelectrical של תאים, ¹⁶ ומין ing על שינויים הנגרמים במאפייני biophysical של תאים. ^17,18 DEP מסורתי מנצל אלקטרודות מישוריים בדוגמת בתוך ערוץ microfluidic ליישם מתח ולגרום לא אחיד שדה חשמלי. ¹³ בזמן הזה הוא טכניקה רבת עוצמה, אתגרים יכולים להתעורר, כגון delamination האלקטרודה ואלקטרוליזה. dielectrophoresis מבוסס מבודד (iDEP) ¹⁹ התייחס האתגרים של עכירות, delamination אלקטרודה, והשפלה המרחבי של שדה האלקטרודה דרך מבני בידוד דפוסים שיגרמו לאי – אחידות בשדה חשמלי DC. iDEP נעשה שימוש כדי להפריד באופן סלקטיבי בתאי חיידקי חיים ומתים, ¹⁹ לבודד נבגי חיידקים, ²⁰ ולתפעל-DNA, ²¹ בין יישומים אחרים. חימום ג 'אול יכול להיות אתגר כי זה יכול להתרחש כתוצאה מהמתח הגבוה DC נדרש לעתים קרובות. כדי לשפר אתגרים אלה, microdevices DEP ללא קשר פותחו. ^22-24

<p class = "jove_content"> הטכניקה המוצגת כאן מנצלת dielectrophoresis מגע (cDEP), שנקראה כך על חוסר קשר ישיר בין אלקטרודות מתכתיות וערוץ המדגם. ²² ייחודיים לאסטרטגיה זו היא ההחלפה של אלקטרודות מתכתיות עם ערוצי האלקטרודה נוזל מלאים פתרון מוליך מאוד. אלקטרודות נוזלים אלה בשילוב capacitively פני מחסום בידוד דק לערוץ המדגם באמצעות מתח AC. ביטול קשר לדוגמא עם אלקטרודות מפחית נושאים הקשורים לשיטות המבוססות על DEP כמו אלקטרוליזה והיווצרות בועה, זיהום מדגם, וdelamination האלקטרודה. כתוצאה מכך, cDEP שימושי במיוחד עבור דגימות ביולוגיות משום שהוא תומך כדאיות של התאים במדגם. חשוב לציין, cDEP יכול לשמור על סטריליות לדוגמא. שבב יכול להיות מוכן במכסת מנוע בתרבית תאים והניסוי יכול להתנהל ללא צורך במגע מדגם לאלקטרודות מתכת או מחייב שהמדגם יהיה פתוח לenvironmeNT. מאגר פשוט יכול להיות קבוע לשקע שבב כדי להקל על התאוששות מדגם סטרילי. בנוסף, הייצור של אלקטרודות נוזל מאותו החומר ביולוגית הפולימר (PDMS) כערוץ המדגם מפחית את העלות הגבוהה שנגרם עם דפוסים מותאמים אישית של אלקטרודות מתכת, הזמן הנדרש לייצור, ומגביל את הצורך בציוד חדר נקי מיוחד לדפוסים הראשוניים של בול פרוסות סיליקון לשימוש חוזר.

תנועה של חלקיקים עקב DEP תלוי במאפיינים של החלקיקים ובינוניים, כמו גם מילויים המרחבי של השדה החשמלי. גורם חלקיקים ותדירות תלויה, הנקרא גורם קלאוזיוס-Mossotti (CM), לוקח את ערך בטווח -0.5 ל1, וקובע את הכיוון של כוח DEP. התדירות שבה גורם CM הוא בדיוק אפס נקראת תדר החיתוך. זו הנקודה שבה שום כוח dielectrophoretic מופעל על חלקיקים וסימן שינויי גורם CM. שלתדר חיתוך ingle לmicrospheres המוצק אינרטי מתרחש כאשר שינויי גורם CM משלילי לחיובי ²⁵ לתאי יונקים במאגר מוליכות נמוכים בסדר הגודל של 0.01 S / מ ', תדר חיתוך ראשון שמעיד על מעבר מNDEP לpDEP קיים ליד 10. – 100 קילוהרץ, ומושפע מהגודל, הצורה, שלד התא, ומאפייני קרום של התא. ^26,27 תדר חיתוך שני במעבר מpDEP למשטר NDEP הוא בסדר גודל של 10 MHz, ומושפע יחס גרעין-ציטופלסמה, מוליכות ציטופלסמה, וreticulum endoplasmic. ²⁷ כוח DEP ניתן ליישם ללא הנוכחות של זרימת נוזל, אך כאן אנו מנצלים נוזל זורם להשגת מיון רציף של חלקיקים מרחפים. ההשפעה המשולבת של כוח dielectrophoretic וכוח הגרר 'סטוקס להכתיב את תנועת translational של חלקיקים.

פיתחנו מכשירים לפעולה בשני תחומי תדרים. frequenc גבוה יותרמכשירי y (100-600 קילוהרץ) פעלו באמצעות pDEP ומיון אצווה השיג של תאים, כמו תאים סרטניים בערמונית ייזום (טיקים), אפיתל פני השחלות תאים עכבריים (Mose), מד"א-MB-231 תאי סרטן השד, או לחיות THP -1 תאים על ידי לכידה סלקטיבי תאים של ריבית על בידוד הודעות ממוקמות בערוץ המדגם. ^28-31 בתדר נמוך (5-100 קילוהרץ) התקנים לפעול ברציפות, וכאשר פעלו בתדירות שבה אוכלוסייה אחת חוויות pDEP אילו חוויות אוכלוסיית הרקע NDEP, יכול להפנות את מסלולי חלקיקים כדי להשיג מיון. ^32-34 מכשירי תדר נמוך אלה היו בשימוש כדי למיין תאים סרטניים לתאי דם אדומים, לקבוע את השינויים במאפיינים דיאלקטרי של שורת תאי Mose מתקדמת, ועל מנת להבהיר את ההשפעות של אי טיפולי sphingolipid רעילים על היפוך מאפיינים אגרסיביים של תאי Mose אגרסיביים. בנוסף, יכול להיות מתוכנן microdevices cDEP לפעול בתפוקה מוגברת, כיום עד 1 מיליליטר / hr. ^31,35

כפי שתוארו, הגמישות והעלות הנמוכה של תהליך הייצור מאפשרים גיאומטריות מכשיר מותאמות במיוחד, המאפשרות ההליך הניסיוני הוצג להיות רלוונטי למגוון רחב של יישומים. המטרה ארוך הטווח של cDEP היא להבין מיון ללא תווית תא והעשרה ברמה קלינית, עם התאוששות מדגם לתרבות או עיבוד שלאחר מכן. הטכניקה המוצגת כאן היא שיטה פשוטה וזולה, מייצור לניסויים, אשר מגבירה את הנגישות של DEP. אנו מדגימים את הכנת שבב cDEP ופרוטוקול הניסוי כדי להשיג אפיון והעשרה של תאי סרטן שחלות מזעירים מניאון.

Protocol

1. בודה מכשיר אב טיפוס cDEP Microfluidic: סקירה בצע את ההליכים שדווחו בעבר 22 באמצעות photoresist ועמוק הריאקטיבי יון תחריט (DRIE) כדי לחרוט את העיצוב הרצוי ערוץ (איור 1) בפרוסות סיליקון (איור 2). להפקיד שכבה דקה של טפלון כדי לשפר את שחרורו של microdevice מפרוסות סיליקון. איור 1. סכמטי של מכשיר מיון נמוך תדר רציף. מדגם ריצות ערוץ שמאל לימין, והוא 500 מיקרומטר רחב עם אילוצים זגזגו ל100 מיקרומטר. שני הזוגות של ערוצי האלקטרודה fluidic להלחין אלקטרודות המקור וכיור, בהתאמה, והם מופרדים מערוץ המדגם על ידי 20 מיקרומטר מחסום PDMS עבה. איור 2. Fabrתהליך ication של מכשיר cDEP. (א) ל60 שניות, אור UV סלקטיבי מגיב עם photoresist נחשף באמצעות דפוס מסכה של הגיאומטריה מכשיר cDEP. (ב) Photoresist מוסר באמצעות מפתח. (ג) עמוק הריאקטיבי יון תחריט (DRIE) משמש כדי לחרוט 50 מיקרומטר תכונות עמוקות, ו -5 דקות של תחריט רטוב על ידי הידרוקסיד tetramethylammonium (TMAH) 25% ב 70 מעלות צלזיוס משמש כדי להפחית את החספוס על הקירות הצדדיים. (ד) ציפוי טפלון נוסף כדי לשפר שחרור מכשיר מ רקיק. (ה) PDMS הוא שפך על חותמת רקיק מחדש שמיש לאחר degassing ונרפא 45 דקות ב100 מעלות צלסיוס (ו) PDMS הוא להסיר את פרוסות סיליקון. PDMS ושקופית זכוכית נקייה נחשפים לאוויר פלזמה למשך 2 דקות ומלוכדים יחד. עטוף את פרוסות בנייר אלומיניום כדי למנוע לשפוך מעל. מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) ב10:01 יחס אלסטומר לסוכן ריפוי, דה גז לכ 20 דקותו, יוצק על גבי פרוסות סיליקון. חום 45 דקות ב100 ° C כדי למנוע נזק לציפוי הטפלון של הבול. אפשר למכשיר להתקרר. לאחר הקירור, הסר את נייר אלומיניום, לקצץ PDMS באמצעות סכין כירורגית, ולהכות את חורי גישה בכניסת ערוץ / יציאה באמצעות אגרופן בוטה המתאימים לגודל של צינורות. כאן, משמש אגרופן בוטה 1.5 מ"מ. יש לנקות את שקופיות מיקרוסקופ זכוכית באמצעות שטיפה של מים וסבון, אתנול, מים די, וייבוש באוויר, בהתאמה. נקה את מכשיר PDMS באמצעות נייר דבק מג'יק. בדוק תחת מיקרוסקופ כדי להיות בטוח ערוצים נקיים. לחשוף את השקופיות ומכשיר PDMS לפלזמת אוויר למשך 2 דקות. לחץ בחוזקה בצד ערוץ של מכשיר לשקופית זכוכית, הימנעות היווצרות של בועות אוויר בין המכשיר והשקופיות (איור 3). איור 3. </strong> (א) המסכה משמשת לphotolithography בייצור פרוסה סיליקון הבולים, ו (ב) מכשיר PDMS הזכוכית סיים עם המדגם וערוצי האלקטרודה נוזל מלא בצבע מאכל ירוק ואדום, בהתאמה. ראה איור 1 עבור ממדים. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה. 2. הכנת תרחיף תא בDEP הצפת חיץ להכין מוליכות נמוכות (100 μS / סנטימטר), אשר יהיה המכונה "חיץ DEP" (סוכרוז 8.5% [w / v], גלוקוז 0.3% [w / v], 0.725% RPMI [w / v]) . 16 להשעות תאי חיץ DEP ב3 x 10 6 תאים / מיליליטר. הנה, תאי אפיתל פני השחלות עכבר בשלב מאוחר סרטני (Mose-L) נמצאים בשימוש. הערה: ניתוח כדאיות נייד בשיטת הרחקת צבע הכחולה trypan הראה ירידה קלה ביכולת קיום(95.1-91.6%) של תאים בשלב מוקדם מוז (Mose-E) הושעו במאגר DEP בטמפרטורת חדר לאחר 5 שעות. הוא ניבא כי ירידה קלה דומה בכדאיות מתרחשת לתאי Mose-L, מצביעה על כך שתאים לא צריכים להיות מאוחסנים בDEP חיץ לטווח ארוך. לצבוע את התאים באמצעות צבע קרום חדיר ניאון, כגון Calcein AM enzymatically הופעל. למדוד מוליכות של ההשעיה התא הצבוע. המוליכות צריכה להיות כ 100 μS / סנטימטר. אם מדידת המוליכות גבוהה מדי, לסובב את המדגם למטה, resuspend במאגר DEP ב3 x 10 6 תאים / מיליליטר ולחזור על מדידת המוליכות. 3. טוען שבב microfluidic cDEP הנח את שבב microfluidic תחת ואקום ל30 דקות. בינתיים, לחתוך חתיכה של צינור גמיש כדי להקיף את המרחק ממשאבת המזרק לבמה מיקרוסקופ שבו שבב microfluidic יהיה ממוקמת. כאן, באורך 6 סנטימטר של צינורותנדרש. צינורות Fit לעקוץ טיפ על מזרק. להעריך את האורך נדרש לצינורות לשקע על ידי חלוקת היעד שנאסף נפח דגימה על ידי שטח החתך של הצינור. חותכים את דורש אורכו של צינור. צייר השעיה תא לתוך מזרק. בדוק שאין בועות נמצאות בצינור או המזרק. עם הסרת שבב מואקום, הכנס את הצינור לשקע וראש ערוץ מדגם במהירות כדי למנוע בועות אוויר שנלכדו בערוצים. לטפוח בעדינות את המזרק כאשר תחול כדי למנוע פקיעת (20 מיקרומטר) הדק בידוד מכשול, אם כי זה כבר ציין כי המכשול יכול לעמוד בתפוקה גבוהה קבועה ליד 5 מיליליטר / שעה ללא פקיעת. לערוצי אלקטרודה ראש, מקום במהירות טיפים פיפטה ריקים בשקע אחד כל ערוץ האלקטרודה fluidic. פיפטה 200 μl של PBS המכיל כמות קטנה של rhodamine B ולטפוח בעדינות להכניס את הנוזל לקצה השני של ערוץ האלקטרודה. שמור על לחץ עדיןעד PBS עם rhodamine B בעליל מתקדם עד הקצה של קצה פיפטה הריק. חזור על פעולה עבור כל אחד מערוצי האלקטרודה. Rhodamine B משמש רק כדי להמחיש fluorescently ערוצי האלקטרודה fluidic. לאחר תחול, למלא כל מאגר קצה פיפטה עם PBS עם היווצרות בועה הימנע B. rhodamine במאגרי קצה פיפטה, ולהסיר כל בועה גלויה על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. לנתק את הצינור לשקע וזורקים כראוי, לאחר מכן להוסיף מאגר צינורות לשקע טרי לאסוף היקף היעד. 4. תדר חיתוך אפיון של תאים באמצעות שבב cDEP מקם את השבב על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה מצוידות במצלמה דיגיטלית (איור 4). איור 4. </strong> (א) התקנה ניסיונית בסך הכל לניסויי cDEP. שבב cDEP ממוקם על הפלטפורמה של מיקרוסקופ ההפוכה. מצלמה שולחת תמונות למחשב להקלטה. משאבת המזרק שומרת על זרימת יניקה מתמדת. גנרטור הפונקציה מייצר אות אשר הגבירה את ידי מגבר המתח הגבוה ומחוברת לשבב cDEP ידי אלקטרודות תיל. אוסצילוסקופ מנטר את האות שנשלחה לשבב. (ב) צפה בפרטים של שבב cDEP וחיבורי fluidic והאלקטרוני. לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה. הר מזרק במשאבת מזרק ולהכניס אלקטרודות חוט לתוך מאגרי ערוץ האלקטרודה fluidic. שאיבה נוזל דרך ב1 מיליליטר / שעה כדי להבטיח קשר טוב בין משאבת המזרק והמזרק. ראייה לבדוק את אורך הערוץ כדי להבטיח זרימה בלתי מופרעת של תאים והיעדר בועות או דליפות. אדוםקצב זרימת uce ל0.005 מיליליטר / שעה. הערה: תפוקה גבוהה ככל 31,35 1 מיליליטר / שעה הושגה במכשירים של גיאומטריות אחרות. למען בטיחות, לבדוק את האלקטרוניקה על ידי הפעלה על הגנרטור הפונקציה, מגבר מתח גבוה, ואוסצילוסקופ, ולהסתגל למתח ותדר רצויים. הנה פרמטרים אלה הם 200 V ו20 קילוהרץ. עם האימות של ביצועים קבילים, את הכוח. חבר אלקטרודות למגבר מתח גבוה. הערה: שימו לב לנהלי בטיחות החשמל המתאימים בעת הפעלת האלקטרוניקה במתח הגבוה המשמש לניסויים אלה. עם השגת זרימה קבועה, להחיל את המתח הרצוי בתדירות הרצויה. בניסוי זה, מתח הוא 200 V RMS בתדרים שבין 5-60 קילוהרץ. קבצי וידאו תיעוד של תגובת התא עם טכניקות עיבוד תמונה (שלב 5) לכמת חלוקת תא בערוץ ולאפיין את תדר החיתוך. כדי לעשות זאת,לשמור על מתח קבוע ומשתנה בתדירות באופן שיטתי. בתחילת וסוף הניסוי, כמו גם באופן אקראי בין ריצות ניסיוניות, להקליט את חלוקת תא שליטה, חלוקת התאים ללא החלת שדה חשמלי. להעריך את משך זמן הנדרש לתאים לזרום מהכניסה למיקום המעקב (כאן, 5 דקות). לאחר קביעת תדר חדש, המתן הסכום הזה של זמן, ולאחר מכן להתחיל בהקלטה (כאן, וידאו 2 דקות של חלוקת תא). 5. עיבוד תמונה לתדר אפיון מחוף לחוף באמצעות תסריט חישוביים, לנתח כל פריים וידאו על ידי מסגרת כדי לקבוע את Y-המיקום היחסי (שבו Z-הכיוון הוא העומק האנכי של הערוץ, ה-Y הכיוון הוא רוחב הערוץ, וה-X כיוון הוא אורך הערוץ) של כל תא או חלקיק fluorescing בצוין קואורדינטת x במורד הזרם מהאזור בכוח DEP גבוה בערוץ. צור גרף של דיס היחסיtribution. השווה את האמצע של ההפצה בכל מתח ותדר באמצע של חלוקת השליטה. למתח נתון ותדרים שונים, לקבוע את תדר החיתוך, שבו קו האמצע תואם את Y-המיקום של הפקד. 6. משתנה הניסוי לבצע מיון תא או העשרה להשעות את התערובת רצויה בחיץ DEP בריכוז כולל של 3 x 10 6 מיליליטר / חלקיקים. כאן, תערובת זו היא תאי Mose-L עם 4 חרוזים fluorescing מיקרומטר במאגר DEP. בצע את השלבים שתוארו קודם לכן כדי להכין את מכשיר cDEP. כדי למיין או להעשיר את תאים מתערובת, לקבוע את התדרים מוצלבים של תאי היעד וחלקיקי הרקע כפי שתוארו קודם לכן. הפעל את הניסוי בתדר בין שני התדרים מוצלבים של תאי היעד וחלקיקי הרקע כך ששתי האוכלוסיות של חלקיקים לחוות כוחות DEP בד ההפךirections. כדי למיין תאי Mose-L ו4 מיקרומטר חרוזים, לפעול microdevice מעל 11.90 ± 0.63 קילוהרץ. תדר החיתוך הראשון של תאי Mose-L דיווח לאחרונה על ידי Salmanzadeh et al. 33 כדי לאסוף את התוכן של מדגם ממוין, להסיר את הצינור לשקע על איסוף היקף היעד, על ידי הצבת אצבע כפפה על פתיחת השקע ובעדינות מושך בצינורות. יוצקים נאסף נפח היעד למאגר לצורך ניתוח נוסף הערה:. שיטות התאוששות מדגם אחרות יכולים לכלול חיבור מאגר קבוע לשבב והסרת הדגימה על ידי pipetting הפשוט.

Representative Results

יש לשים לב DEP איכותי בערוץ המדגם כדי לאשר את המכשיר הוא מבצעי, כאשר השדה החשמלי הוא הווה. שיטה אחת לבדיקת הנוכחות של DEP היא להתאים את התדירות לערכים רחוק מתדר החיתוך שבי pDEP החזק וNDEP הם חזו (בערך> 40 קילוהרץ להתבונן pDEP ו< 10 קילוהרץ להתבונן NDEP עבור רוב התאים סרטניים ביונקים חיץ עם מוליכות של 100 μS / סנטימטר). יצוין, כי זעירים מאינרטי תערוכת pDEP מתחת תדר החיתוך שלהם וNDEP מעל תדר החיתוך שלהם. לגיאומטרית התכונה זגזגה שהוצגה כאן, pDEP יש לראות לתאים בתדירות גבוהה יותר במבחנים, שמסומן על ידי המופע של פנינת שרשור והתמקדות של תאים או חלקיקים בקצה התכונה זגזג של הערוץ, ובה בתדירות הבדיקה נמוכה יותר, NDEP צריך להיות ברור כמו תאים מוגבלים לאזור קרוב יותר לקצה הישר של הערוץ. בתדרים נמוכים אלה, תאים עשויים יסדואר בשל electroporation, כך לדוגמא עשוי להיראות מכיל פחות תאים, ואלו שאינם נראים לעין עשויים להופיע מוגדלים או מטושטש אם באמצעות צבע fluorescing enzymatically הופעל. אימות התדרים שבי pDEP וNDEP להתרחש מאפשרת קביעת התדר החיתוך כפי שתואר בפרוטוקול. לתאי יונקים בסרטן, כמו Mose-L משמשים כאן, צפינו NDEP ב5 קילוהרץ (איור 5 א) וpDEP החזק ב60 קילוהרץ (איור 5). היו לי תאי Mose-L קוטר של 17.7 ± 3.3 מיקרומטר (n = 268 תאים) ויש לי את החרוזים בקוטר נומינלי 4 מיקרומטר. ניתן למצוא ניתוח מלא של מאפייני דיאלקטרי של תאי Mose-L בהשוואה לתאי Mose בשלבים מוקדמים יותר של התקדמות בעבודה האחרונה על ידי Salmanzadeh et al. 33 אם pDEP וNDEP לא נצפו בקצוות הללו, בעיות שונות יכולה להיות התרחשות. מוליכות המדגם עלולות להיות גבוהות מדי בשל מזהמים או lysing תא. Insufficieשדה חשמלי NT יכול להיות שנוצר עקב בועות לכודות בערוצי האלקטרודה הנוזל, המונעים הולכה של זרם לחלק מהערוצים הגובלים בערוץ המדגם. זרימה לא יציבה עלולה להיגרם על ידי בועה לכודה במזרק או צינורות יניקה, בועות וכתוצאה מלא שמירה על המכשיר תחת ואקום למספיק זמן או לא ממלאים את המכשיר במהירות על הסרת מואקום, דליפה בשל delamination של PDMS מלוכד היטב ל שקופיות זכוכית, דמעות בקרום המחסום בשל כוח מופרז שהופעלו בעת מילוי הערוצים, או ספיקות בקצוות של טווח ההפעלה המשאבה. בנוסף לקביעת תדר החיתוך של תאים, בטכניקה זו ניתן להשתמש כדי למיין תערובת, כמתואר כאן בתערובת של תאי Mose-L וחרוזים. דוגמא זו מנצלת את dielectrophoresis השלילי (NDEP) הוצג על ידי 4 מיקרומטר חרוזים בתדרים שבו תאי Mose-L לחוות dielectrophoresis החיובי (pDEP). אנו operated המכשיר ב200 V RMS ו10 קילוהרץ (איור 6 א) וציין כי שני תאים וחרוזים היו מעורבים כפי שהם חוו NDEP. ב50 קילוהרץ צפינו תנועה של תאי Mose-L לחלק העליון של הערוץ, בעוד שחרוזים היו מוגבלים לחלק התחתון של הערוץ, מה שמאפשר הפרדה של התערובת לשני רכיבים (6 ב איור). איור 5. העמדה של תאי Mose-L היא מניפולציה על ידי שינוי התדר של השדה החשמלי מיושם. התמונות נלקחות בתכונה זגזגה הסופית בערוץ המדגם ואלקטרודות fluidic ממוקמות בפינות בצד ימין. הם מלאים בPBS המכיל rhodamine B, שמאיר לדמיין את הערוצים. (א) תאי Mose-L לחוות NDEP ב200 V RMS ו5 קילוהרץ. (ב) תאי Mose-L לחוות שרשור פנינה וpDEP ב200 V RMS ו60 קילוהרץ. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה. איור 6. תערובת של תאי Mose-L (ירוק) ו 4 מיקרומטר חרוזים (אדום) לזרום דרך התכונה זגזגה הסופית בערוץ המדגם של מכשיר cDEP תדר נמוך. (א) ב200 V ו10 תאי קילוהרץ וחרוזים מעורבבים. חיצים מצביעים על הופעה קלושה תאים שסביר להניח שמתו בשל התנאים בתדר נמוכים. (ב) ב200 V ו50 תאי קילוהרץ לחוות pDEP ולעבור לקצה התכונה של הערוץ, ואילו חרוזים לחוות NDEP ויישארו מוגבלים לאזור הקרוב יותר הקצה ישר."Target =" _blank p_upload/50634/50634fig6highres.jpg "> לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

Discussion

DEP הוא טכניקה רבת עוצמה לקביעת מאפייני דיאלקטרי של חלקיקים ומכוונים את תנועת חלקיקים לכיוון מיון יישומים, בידוד, או העשרה. בשל ההשפעה המזיקה של קשר האלקטרודה ישיר עם מדגם, אחרים תפס את הגישות דומות לשיטה שהוצגה בעבר להימנע ממגע. לדוגמא, בשיר ואח'. פיתח מכשירי DEP ללא קשר באמצעות מכשיר PDMS microfluidic הופרד מאלקטרודות המעגלים מודפסות ידי coverslip זכוכית דק, וטכניקה זו נעשית זמינה גם בפורמט וידאו. ^23,36

הנה, יש לנו הראינו את הייצור של שבב cDEP ואלקטרודות fluidic באמצעות מצע PDMS יחיד, ופרוטוקול הניסוי להפרדת תאי סרטן שחלות מתערובת של תאים וחרוזי ניאון. הטכניקה הוצגה שמשה בהצלחה עבור מגוון רחב של יישומים מורכבים יותר ורלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, כולל מיון ליבתאי דואר ומתים, גידול ²⁸ ייזום תאים מתאי סרטן ערמונית, ³⁰ תאים סרטניים לתאים לדלל דם אדומים, ^31,32 והבחנה בין שלבים של סרטן השד ³⁷ וסרטן השחלות. ²⁹ cDEP שימשו גם לערבוב חלקיקים. ³⁸ אלה יישומים מצביעים על כך שעל ידי שימוש בטכניקה הפשוטה שהוצגה, ניתן להשיג מטרות מגוונות פשוט על ידי שינוי העיצוב של הגיאומטריה הערוץ.

. DEP הוא שימושי על microscale למניפולציה של חלקיקי ¹³ לחלקיקים כדוריים, כוח dielectrophoretic translational תלוי במאפייני הגודל וחשמלי של החלקיקים והבינוניים המתלים שלה, כמו גם את השיפוע של השדה החשמלי בריבוע:

שבו _{מ 'ε} הוא permittivity של המדיום המתלים, r הוא הרדיוסשל החלקיקים, וRC [k (ω)] הוא החלק האמיתי של גורם קלאוזיוס-Mossotti (CM). גורם CM הוא מדד של הקיטוב היחסי של החלקיקים בהשוואה למדיום המתלים וקובע את הכיוון של כוח dielectrophoretic. היא מתוארת כ

איפה ו – הם permittivities המורכב של החלקיקים ובינוניים, בהתאמה. Permittivity מורכב, , תלוי במוליכות (σ) ותדירות (ω). גורם CM של חלקיקים כדוריים מחויב באופן תיאורטי בין -0.5 ו1. אם גורם CM הוא שלילי, החלקיקים לחוות NDEP כי המדיום הוא יותר polarizable מאשר החלקיקים, ולכן חלקיקים להתרחק מאזורים שלהדרגות שדה חשמליות גבוהות. אם גורם CM הוא חיובי, החלקיקים יותר polarizable מהבינוני והם חווים pDEP שבו הם נעים לעבר אזורים של הדרגות שדה חשמלי גבוהות.

עבור חלקיקים ביולוגיים שהם nonhomogeneous במבנה, כגון תאים, גורם קלאוזיוס-Mossotti ניתן לקבוע מן הערך יעיל לpermittivity החלקיקים:

איפה ו – הם permittivity המורכב של permittivity מורכב היעיל של הפנים של התא, כגון ציטופלסמה, וקרום הפלזמה, בהתאמה;. r הוא הרדיוס של התא, וד הוא עובי קרום הפלזמה ²⁶

כאשר DEP מתרחש עם חלקיקים מרחפים בנוזל, התנועה של החלקיק ביחס לנוזל תפיק כוח גרר על החלקיק. כוח גרר זה יש לקחת בחשבון בעת קביעת הכוח הכולל הפועל על החלקיקים. למצבים של עניין כאן, כוחות צמיגי לשלוט וחלקיקים הם הניחו כדוריים, קטנים ונעים עם מהירות נמוכה יחסית, ולכן החוק גרור 'סטוקס מספק קירוב טוב לכוח הגרר:

שבו η הוא הצמיגות של הנוזל, _{עמ 'u} הוא המהירות של החלקיקים, _וו u הוא המהירות של הנוזל, שיכול להיות גם מרגש. בהתחשב בכוח dielectrophoretic, הידוע בנוזל ותכונות חלקיקים, ומהירות זרימה ידועה, האיזון בין כוח הגרר וכוח dielectrophoretic ניתן לפתור להעריך את מהירות חלקיקים. שיעור הגזירה שהחוויה התאים צריכה להיות מתחת לסף שבו גell lysing יכול להתרחש.

אפיון של התכונות חשמליות של חלקיקים יש צורך לחזות ולשלוט באופן שהם יגיבו תחת DEP. בעבודה זו, אנו מנוצלים במיוחד cDEP תדר נמוך עם תאי Mose-L כדי להדגים את הפרוטוקול לקביעת תדר החיתוך הראשון של תאים, ולאחר מכן הראו מיון מתמשך של חרוזי פוליסטירן ותאי Mose-L מבוסס על תשובות DEP המנוגדות שלהם.

לשנות את הגיאומטריה של מכשיר cDEP תשתנה הדרגתיים המרחבי של השדה החשמלי, המאפשרת למכשירים להיות מיועדים בתדירות גבוהה או בהפעלתה בתדירות נמוכה, ולסלקטיביות גבוהה ויעילות של מיון לסוג תא מסוים. בנוסף, ניתן לפתח מכשירי תפוקה גבוהים על ידי בודה ערוצים רחבים יותר, ³⁰ ערוצים במקביל, ³⁰ או על ידי ייצור רב שכבתי ^35, שבו ערוצי האלקטרודה נערמים אנכי מעל ומתחת עמוק יחסיתערוץ מדגם. קרומים דקים יוצרים חיץ בין שכבות. בדיקות ראשוניות עם מכשירים המפוברק בpolymethylmethacrylate (PMMA) וסרטים דקים פוליקרבונט (PC) הדגימו תגובת DEP של תאי Mose-L. מאמצים הנוכחיים נמצאים בעיצומם כדי לחדד את מכשירי תפוקה גבוהה רב שכבתיות ועל מנת לשפר את המערכת ההיקפית לכיוון פלטפורמת Plug-and-Play סופו של דבר. כדי להרחיב את מהטכניקה הניסויית הבסיסית שהוצגה, ניתן להתאים את היישומים ואת המפרט של המכשיר כדי שיתאימו לדרישות מסוימות, כגון מיון לעומת אפיון, או הוספת מאגרי מדגם ומערכת חצי אוטומטית למכשיר.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת כבר נתמכת בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט לא אפרי 0938047, ועל ידי וירג'יניה טק המכון לקריטי טכנולוגיה ומדע יישומי (ICTAS). המחברים מבקשים להביע את ההערכה לד"ר אווה שמלץ וד"ר פול רוברטס למתנה מסוגם של תאי Mose-L. המחברים מודים אנג'לה אנדרסון על סיועה בתרבית תאים, Caitlan Swaffar על עזרתה בעריכת המסמך והכנת ניסויים, וכל חברי המעבדה Bioelectromechanical המערכות.

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning, Midland, MI,USA	Sylgard 184
Glass slides	The Microscope Depot	76079	2×3 inch-ground edges
Microbore PTFE Tubing	Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA	EW-06417-31	Thin walled 20 gauge, 0.032″ID x 0.056″OD, 100 ft/roll
Luer-slip plastic syringes	National Scientific company	S7510-1
Needle tip	Howard Electronic instruments	JG20-1.0	20 Gauge 1.0″, ID=0.025″ OD=0.036″
D(+)-Sucrose	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S3-500
D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous	Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ	AC410955000
RPMI-1640 Medium	Quality Biological Inc.	112-025-101
Calcein AM, Molecular Probes	Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA	C3100MP	excitation wavelength 488/emission wavelength 516
Rhodamine B, O	Science Lab	SLR1465-100G	excitation wavelength 540/emission wavelength 625
Phosphate buffered saline (10X)	Gbiosciences, St. Louis, MO	RC-147
Leica, inverted light microscope	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	Leica DMI 6000B
Leica DFC420, color camera	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	Leica DFC420
Function generator	GW Instek, Taipei, Taiwan	GFG-3015
Wideband power amplifier	Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA	AL-50HF-A
HFHV Output Transformer		AL-T50-V25/300-F100K-600K
High voltage amplifier	Trek	Model 2205
USB Modular Oscilloscope, 100 MHz	AgilentTechnologies	U2701A
Expanded Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-001/002 (115/230V)	air plasma
Scotch Magic tape	3M		any available width is sufficient
1.5 mm puncher	Harris Uni-Core	Z708836-25EA
.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
FluoSpheres Sulfate Microspheres	Invitrogen	F8858	4.0 μm, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)
AZ 9260 photoresist	AZ Electronic Materials
AZ 400 K developer	AZ Electronic Materials
Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%			provided by Virginia Tech cleanroom
Teflon coating			applied using DRIE machine
Silicon wafer	University Wafer	452	100 mm diameter, 500 μm thickness, one side polished (SSP)
Deep Reactive Ion Etching (DRIE)	Alcatrel	AMS SDE 100

References

Butler, M. . Cell culture and upstream processing. , (2007).
Pratt, E. D., Huang, C., Hawkins, B. G., Gleghorn, J. P., Kirby, B. J. Rare Cell Capture in Microfluidic Devices. Chemical Engineering Science. 66, 1508-1522 (2011).
Salmanzadeh, A. D., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science and Technology. 3, e112 (2013).
Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. The Review of Scientific Instruments. 43, 404-409 (1972).
Adams, J. D., Kim, U., Soh, H. T. Multitarget magnetic activated cell sorter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18165-18170 (2008).
Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3191-3196 (2008).
Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18892-18897 (2007).
Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9, 3038-3046 (2009).
Grover, S. C., Skirtach, A. G., Gauthier, R. C., Grover, C. P. Automated single-cell sorting system based on optical trapping. J. Biomed. Opt. 6, 14-22 (2001).
Lin, S. C. S., Mao, X. L., Huang, T. J. Surface acoustic wave (SAW) acoustophoresis: now and beyond. Lab Chip. 12, 2766-2770 (2012).
Pethig, R. Review Article-Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, (2010).
Gascoyne, P. R. C., Wang, X. B., Huang, Y., Becker, F. F. Dielectrophoretic separation of cancer cells from blood. Ieee T. Ind. Appl. 33, 670-678 (1997).
Pohl, H. A. . Dielectrophoresis : the behavior of neutral matter in nonuniform electric fields. , (1978).
Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science. , (2012).
Markx, G. H., Talary, M. S., Pethig, R. Separation of Viable and Nonviable Yeast Using Dielectrophoresis. J. Biotechnol. 32 (94), 29-37 (1994).
Flanagan, L. A., et al. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 26, 656-665 (2008).
Labeed, F. H., Coley, H. M., Thomas, H., Hughes, M. P. Assessment of multidrug resistance reversal using dielectrophoresis and flow cytometry. Biophys. J. 85, 2028-2034 (2003).
Hoettges, K. F., et al. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Anal. Chem. 80, 2063-2068 (2008).
Lapizco-Encinas, B. H., Simmons, B. A., Cummings, E. B., Fintschenko, Y. Insulator-based dielectrophoresis for the selective concentration and separation of live bacteria in water. Electrophoresis. 25, 1695-1704 (2004).
Davalos, R. V., et al. Performance impact of dynamic surface coatings on polymeric insulator-based dielectrophoretic particle separators. Anal. Bioanal. Chem. 390, 847-855 (2008).
Gallo-Villanueva, R. C., Rodriguez-Lopez, C. E., Diaz-De-La-Garza, R. I., Reyes-Betanzo, C., Lapizco-Encinas, B. H. DNA manipulation by means of insulator-based dielectrophoresis employing direct current electric fields. Electrophoresis. 30, 4195-4205 (2009).
Shafiee, H., Caldwell, J. L., Sano, M. B., Davalos, R. V. Contactless dielectrophoresis: a new technique for cell manipulation. Biomed Microdevices. 11, 997-1006 (2009).
Park, K., Suk, H. J., Akin, D., Bashir, R. Dielectrophoresis-based cell manipulation using electrodes on a reusable printed circuit board. Lab Chip. 9, 2224-2229 (2009).
Jen, C. P., Maslov, N. A., Shih, H. Y., Lee, Y. C., Hsiao, F. B. Particle focusing in a contactless dielectrophoretic microfluidic chip with insulating structures. Microsyst Technol. 18, 1879-1886 (2012).
Hughes, M. P. AC electrokinetics: applications for nanotechnology. Nanotechnology. 11, 124-132 (2000).
Pethig, R. Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, 022811 (2010).
Pethig, R., Ferrari, M. a. u. r. o., Ozkan, M. i. h. r. i. m. a. h., Heller, M. i. c. h. a. e. l. . J. .. Ch. 4. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. 4, 103-126 (2007).
Shafiee, H., Sano, M. B., Henslee, E. A., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Selective isolation of live/dead cells using contactless dielectrophoresis (cDEP). Lab Chip. 10, 438-445 (2010).
Salmanzadeh, A., et al. Dielectrophoretic differentiation of mouse ovarian surface epithelial cells, macrophages, and fibroblasts using contactless dielectrophoresis. Biomicrofluidics. 6, (2012).
Salmanzadeh, A., et al. Isolation of prostate tumor initiating cells (TICs) through their dielectrophoretic signature. Lab Chip. 12, 182-189 (2012).
Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M., Davalos, R. V. Isolation of Rare Cancer Cells from Blood Cells Using Dielectrophoresis. , (2012).
Sano, M. B., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Modeling and development of a low frequency contactless dielectrophoresis (cDEP) platform to sort cancer cells from dilute whole blood samples. Biosens. Bioelectron. 30, 13-20 (2011).
Salmanzadeh, A., et al. Investigating Dielectric Properties of Different Stages of Syngeneic Murine Ovarian Cancer Cells. Biomicrofluidics. , (2013).
Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M. A., Davalos, R. V. . , 590-593 (2012).
Sano, M. B., Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations. Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).
Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar. J. Vis. Exp. (48), e2545 (2011).
Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).
Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Elvington, E. S., Salmanzadeh, A., Stremler, M. A., Davalos, R. V. Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis. J. Vis. Exp. (79), e50634, doi:10.3791/50634 (2013).

Automatically Generated