Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Elizabeth S. Elvington; Alireza Salmanzadeh; Mark A. Stremler; Rafael V. Davalos

doi:10.3791/50634

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Medicine

L'isolement et l'enrichissement des cellules sans étiquette Grâce contact Diélectrophorèse

Published: September 03, 2013

doi:

10.3791/50634

Elizabeth S. Elvington¹, Alireza Salmanzadeh^1,2, Mark A. Stremler^1,2, Rafael V. Davalos^1,2

¹School of Biomedical Engineering and Science,Virginia Tech, ²Department of Engineering Science and Mechanics,Virginia Tech

Summary

Contact diélectrophorèse (CDEP) réalise le tri et l'enrichissement de particules par leurs propriétés diélectriques intrinsèques. Canaux d'électrodes fluidiques remplacent électrodes métalliques traditionnelles de DEP, convenant CDEP à la non-qualification endommager stérile et le tri des particules biologiques. Nous démontrons comment préparer un micro CDEP et effectuer la caractérisation des cellules et des expériences de tri.

Abstract

La diélectrophorèse (DEP) est le phénomène par lequel des particules polarisées dans un champ électrique non uniforme subissent un mouvement de translation, et peut être utilisé pour diriger le mouvement de microparticules d'une manière indépendante de marqueur surface. Traditionnellement, les dispositifs DEP comprennent des électrodes métalliques planes à motif dans le canal d'échantillon. Cette approche peut être coûteuse et nécessite un environnement de salle blanche spécialisée. Récemment, une approche sans contact appelée diélectrophorèse contact (CDEP) a été développé. Cette méthode utilise le principe classique de DEP, tout en évitant un contact direct entre les électrodes et l'échantillon par structuration des électrodes fluidiques et un canal d'échantillon à partir d'une seule polydiméthylsiloxane (PDMS) substrat, et a une application en tant que stratégie rapide microfluidique conçu pour trier et enrichir des microparticules. La particularité de ce procédé est que le champ électrique est généré via des canaux fluidiques d'électrode contenant un fluide hautement conducteur, qui sont séparées l'canal de l'échantillon par une mince barrière isolante. Parce électrodes métalliques ne touchent pas directement l'échantillon, l'électrolyse, l'électrode délamination et la contamination de l'échantillon sont évités. En outre, cela permet un procédé de fabrication simple et peu coûteuse.

CDEP est donc bien adapté pour la manipulation de particules biologiques sensibles. La force diélectrophorétique agissant sur les particules dépend non seulement de gradients de champ électrique généré par la conception personnalisable de la géométrie du dispositif, mais les propriétés biophysiques intrinsèques de la cellule. En tant que tel, CDEP est une technique sans étiquette qui évite selon biomarqueurs moléculaires exprimées en surface qui peut être variable exprimés dans une population, tout en permettant la caractérisation, l'enrichissement et le tri des particules biologiques.

Ici, nous démontrons les bases de la fabrication et de l'expérimentation à l'aide CDEP. Nous expliquons la préparation simple d'une puce CDEP utilisant lithographie doucetechniques y. Nous discutons le mode opératoire expérimental pour la caractérisation de fréquence de coupure d'une particule ou d'une cellule, la fréquence à laquelle la force diélectrophorétique est égal à zéro. Enfin, nous démontrons l'utilisation de cette technique pour le tri d'un mélange de cellules de cancer de l'ovaire et fluorescent microsphères (billes).

Introduction

Enrichissement de l'échantillon biologique et le tri des particules est souvent nécessaire pour une analyse ultérieure. ¹ Par exemple, l'isolement de cellules rares à partir de fluides corporels a d'importantes applications dans la détection du cancer et de la médecine personnalisée. ^2,3 Les techniques d'enrichissement les plus couramment utilisés sont cellulaire activé par fluorescence (FACS ) ⁴ et magnétique tri cellulaire activé (MACS), ⁵ qui s'appuient sur des marqueurs de surface exprimés à différencier les cellules. D'autres stratégies comprennent hydrodynamique inertie ⁶ ou ^7,8 tri, des pinces optiques, acoustophorèse ^{9, 10} et diélectrophorèse. ^11,12 diélectrophorèse est le mouvement d'une particule polarisée en présence d'un champ électrique non uniforme. DEP ¹³ a été utilisé pour une large gamme d'applications, y compris les cellules ^2,14 tri sur la base de la viabilité, ¹⁵ caractérisant les propriétés bioélectriques des cellules, ¹⁶ et trition sur les changements induits dans les propriétés biophysiques des cellules. ^17,18 DEP traditionnelle utilise des électrodes planes motifs dans un canal microfluidique à appliquer une tension et induire une non-uniforme champ électrique. ¹³ Bien que ce soit une technique puissante, les défis peuvent survenir, tels que électrode délaminage et l'électrolyse. Diélectrophorèse base isolant (IDEP) ¹⁹ a abordé les défis de l'encrassement, électrode délamination et la dégradation spatiale du champ de l'électrode à travers des structures isolantes de motifs qui induisent des inhomogénéités dans un champ électrique continu. IDEP a été utilisé pour séparer sélectivement les cellules vivantes et mortes bactéries, ¹⁹ isoler les spores bactériennes, ²⁰ et manipuler l'ADN, ²¹ entre autres applications. Chauffage par effet Joule peut être un défi, car il peut se produire en raison de la haute tension à courant continu souvent requises. Pour améliorer ces défis, microdevices DEP sans contact ont été développés. ^22-24

<p class = "jove_content"> La technique présentée ici utilise contact diélectrophorèse (CDEP), ainsi nommé pour le manque de contact direct entre les électrodes métalliques et le canal de l'échantillon. ²² Unique à cette stratégie est le remplacement des électrodes métalliques avec canaux d'électrodes liquides remplis de une solution hautement conducteur. Ces électrodes de fluide sont couplés de manière capacitive à travers une mince barrière isolante au canal d'échantillon par l'intermédiaire d'une tension alternative. Éliminant le contact de l'échantillon avec des électrodes permet de réduire les problèmes associés aux méthodes basées sur la DEP tels que l'électrolyse et la formation de bulles, la contamination de l'échantillon, et l'électrode de délaminage. En conséquence, CDEP est particulièrement utile pour des échantillons biologiques, car elle prend en charge la viabilité des cellules dans l'échantillon. Surtout, CDEP peut maintenir échantillon stérilité. Une puce peut être préparé dans une hotte de culture cellulaire et l'expérience peut être réalisée sans nécessiter de contact avec l'échantillon à des électrodes métalliques ou en exigeant que l'échantillon soit ouvert à l'environnement à l'nt. Un réservoir simple peut être fixé à la sortie de la puce pour faciliter la récupération de l'échantillon stérile. En outre, la fabrication d'électrodes de fluide à partir de la même matière polymère biocompatible (PDMS), comme le canal d'échantillon réduit le coût élevé supporté à motif personnalisé d'électrodes métalliques, le temps nécessaire à la fabrication et limite la nécessité d'un équipement de salle blanche spécialisé pour la structuration initiale de l'estampille plaquette de silicium réutilisable.

Mouvement de particules en raison de DEP dépend des caractéristiques de la particule et le milieu, ainsi que les gradients spatiaux du champ électrique. Une particule et le facteur dépendant de la fréquence, appelé le facteur de Clausius-Mossotti (CM), prend une valeur dans la plage de -0,5 à 1, et détermine la direction de la force DEP. La fréquence à laquelle le facteur de CM est exactement zéro est appelée la fréquence de coupure. Ceci est le point auquel aucune force diélectrophorétique est exercée sur une particule et le signe des variations de facteur de CM. Un single fréquence de croisement pour des microsphères solides inertes se produit lorsque le facteur de CM changements de négatif à positif ²⁵ Pour des cellules de mammifère dans un tampon de faible conductivité de l'ordre de 0,01 S / m, une première fréquence de croisement indiquant une transition d'nDEP à pDEP existe près de 10. – 100 kHz, et est influencé par la taille, la forme, cytosquelette, et les propriétés de la membrane de la cellule. ^26,27 Une seconde fréquence de coupure à un passage du régime de pDEP nDEP est de l'ordre de 10 MHz, et est influencé par l' noyau-cytoplasme rapport, cytoplasme conductivité, et réticulum endoplasmique. ²⁷ force DEP peut être appliqué sans la présence d'un écoulement de fluide, mais ici nous utilisons un fluide en écoulement continu pour atteindre le tri des particules en suspension. L'influence combinée de la force diélectrophorétique et la force de traînée de Stokes de dicter le mouvement de translation d'une particule.

Nous avons développé des dispositifs pour le fonctionnement dans deux bandes de fréquences. Frequenc supérieurdispositifs y (100-600 kHz) ont fonctionné en utilisant pDEP et atteint tri des cellules du lot, tels que les cellules tumorales de la prostate amorçage (tics), de l'ovaire épithéliales de surface (MOSE) des cellules murines, MDA-MB-231 cellules de cancer du sein, ou vivre THP -1 cellules par piégeage sélectivement les cellules d'intérêt sur les postes situés dans le canal de l'échantillon isolant. ^28-31 de fréquence inférieure (5-100 kHz) dispositifs fonctionnent en continu, et lorsqu'il est utilisé à une fréquence à laquelle un population éprouve pDEP tandis que l'arrière-plan des expériences de la population nDEP, peut rediriger les trajectoires des particules de réaliser le tri. ^32-34 Ces dispositifs de basse fréquence sont utilisés pour trier les cellules cancéreuses à partir de cellules rouges du sang, de déterminer des changements dans les propriétés diélectriques d'une lignée cellulaire de MOSE progressive, et d'élucider les effets de la non- traitements sphingolipides toxiques sur l'inversion des caractéristiques agressives de cellules MOSE agressifs. En outre, microdevices CDEP peuvent être conçus pour fonctionner à un débit accru, actuellement à 1 ml / hr. ^31,35

Comme décrit, la flexibilité et le faible coût du processus de fabrication permet géométries de dispositifs conçus sur mesure, qui permettent à la procédure expérimentale présentée est pertinente pour un large éventail d'applications. L'objectif à long terme de CDEP est de réaliser sans étiquette tri cellulaire et l'enrichissement sur le plan clinique, avec récupération de l'échantillon pour la culture ou le traitement ultérieur. La technique présentée ici est une méthode simple et peu coûteuse, de la fabrication à l'expérimentation, ce qui augmente l'accessibilité du DEP. Nous démontrons la préparation d'une puce CDEP et le protocole expérimental pour réaliser la caractérisation et l'enrichissement de cellules cancéreuses d'ovaire de microsphères fluorescentes.

Protocol

Une. Fabrication d'un dispositif prototype CDEP microfluidique: Vue d'ensemble Suivez les procédures précédemment rapportés 22 en utilisant résine photosensible et gravure ionique réactive profonde (DRIE) pour graver la conception de canal désiré (figure 1) dans une plaquette de silicium (figure 2). Déposer une mince couche de Téflon afin d'améliorer la libération du microdispositif à partir de la plaquette. Figure 1. Schéma d'un dispositif à faible tri continue de fréquence. L'échantillon canal fonctionne de gauche à droite et 500 m de large avec des rétrécissements en dents de scie de 100 um. Les deux paires de canaux fluidiques composent d'électrodes de source et de puits électrodes, respectivement, et sont séparés du canal d'échantillon par une barrière d'épaisseur 20 um de PDMS. Figure 2. Le fabrprocessus de ication d'un dispositif CDEP. (a) Pour 60 secondes, la lumière UV réagit sélectivement avec résine photosensible exposée à travers un motif de masque de la géométrie du dispositif CDEP. (b) Photoresist est éliminé en utilisant développeur. (c) gravure ionique réactive profonde (DRIE) est utilisé pour graver 50 um caractéristiques de profondeur, et à 5 min de gravure par voie humide par l'hydroxyde de tétraméthylammonium (TMAH) à 25% à 70 ° C est utilisé pour réduire la rugosité des parois latérales. (d) un revêtement de Téflon est ajouté pour améliorer la libération de l'appareil à partir de la plaquette. (e) PDMS est versée sur la plaquette tampon réutilisable après dégazage et durci pendant 45 minutes à 100 ° C. (f) PDMS est retiré de la plaquette. PDMS et d'une lame de verre propre est exposé à un plasma d'air pendant 2 min et liées ensemble. Enveloppez la tranche d'une feuille d'aluminium pour éviter de débordement. Mélanger le polydiméthylsiloxane (PDMS) à 10:1 en élastomère à l'agent de durcissement, de-gaz pendant environ 20 min, Et versez sur la plaquette. Chauffer pendant 45 min à 100 ° C pour éviter d'endommager le revêtement de Téflon du timbre. Laissez l'appareil refroidir. Après refroidissement, retirez le papier d'aluminium, de l'assiette PDMS en utilisant une lame chirurgicale, et le punch des trous d'accès à l'entrée du canal / sortie en utilisant un perforateur émoussé adaptée à la taille de tube. Ici, un perforateur émoussé 1,5 mm est utilisé. Nettoyer une lame de microscope en verre à l'aide d'un rinçage de l'eau et du savon, de l'éthanol, de l'eau déminéralisée, et le séchage à l'air, respectivement. Nettoyez l'appareil PDMS en utilisant du ruban Scotch Magic. Examiner au microscope pour être sûr canaux sont propres. Exposer la lame et dispositif de PDMS à plasma d'air pendant 2 min. Appuyez fermement côté du canal de dispositif à lame de verre, en évitant la formation de bulles d'air entre l'appareil et le chariot (Figure 3). Figure 3. </strong> (a) Le masque utilisé pour la photolithographie au cours de la fabrication de timbre plaquette de silicium, et (b) le dispositif de PDMS-verre fini avec l'échantillon et canaux d'électrodes liquides remplis avec du colorant alimentaire vert et rouge, respectivement. Voir la Figure 1 pour les dimensions. Cliquez ici pour agrandir la figure . 2. Préparation d'une suspension de cellules dans le tampon DEP Préparer une faible conductivité (100 uS / cm) tampon, qui sera dénommé "tampon DEP» (8,5% de saccharose [w / v], 0,3% de glucose [w / v], 0,725% RPMI [w / v]) 16. Suspendre les cellules dans un tampon DEP à 3 x 10 6 cellules / ml. Ici, les cellules cancéreuses de souris à un stade avancé de l'ovaire épithélial de surface (MOSE-L) sont utilisés. Remarque: l'analyse de la viabilité cellulaire par la méthode d'exclusion du colorant bleu trypan a montré une légère diminution de la viabilité(De 95,1 à 91,6%) de MOSE (MOSE-E), les cellules de stade précoce en suspension dans un tampon DEP à la température ambiante après 5 h. Il est prévu qu'une légère diminution similaire se produit pour la viabilité des cellules MOSE-L, indiquant que les cellules ne doivent pas être stockés dans DEP tampon à long terme. Teindre les cellules en utilisant un colorant fluorescent membrane perméable, telle que la voie enzymatique activé par la calcéine AM. Mesurer la conductivité de la suspension de cellules teint. La conductivité doit être d'environ 100 uS / cm. Si la mesure de la conductivité est trop élevé, faites tourner l'échantillon vers le bas, remettre en suspension dans un tampon DEP à 3 x 10 6 cellules / ml et répéter la mesure de la conductivité. 3. Chargement de la CDEP microfluidique Chip Placer la puce microfluidique sous vide pendant 30 min. Pendant ce temps, couper un morceau de tuyau flexible pour couvrir la distance de la pompe de la seringue à la platine du microscope où sera située la puce microfluidique. Ici, une longueur de 6 pouces de tubeest nécessaire. Prévoir un tuyau à l'aiguille pointe sur la seringue. Estimer la longueur requise pour un tube de sortie en divisant le volume d'échantillon prélevé cible par l'aire de section transversale du tube. Couper le nécessitent longueur de tube. Dessinez suspension de cellules dans la seringue. Vérifier que l'absence de bulles sont situés dans la tubulure ou de la seringue. Après retrait d'une puce de vide, insérer le tube de sortie et le premier canal de l'échantillon rapidement pour éviter les bulles d'air piégées dans les canaux. Tapoter doucement la seringue lors de l'amorçage pour éviter la rupture de la mince (20 mm) barrière isolante, mais il a été observé que la barrière peut résister à un débit élevé constant près de 5 ml / h sans se rompre. Pour les premiers canaux d'électrode, placer rapidement des embouts de pipette vides dans une sortie de chaque canal d'électrode fluidique. Introduire à la pipette 200 ul de PBS contenant une petite quantité de rhodamine B et tapoter doucement pour introduire le fluide dans l'extrémité opposée du canal de l'électrode. Maintenir une légère pressionjusqu'à PBS avec de la rhodamine B progresse visiblement jusqu'à la pointe de l'embout de pipette vide. Répétez l'opération pour chaque canal de l'électrode. La rhodamine B est utilisée pour visualiser la fluorescence uniquement les canaux d'électrode fluidiques. Après amorçage, remplir chaque réservoir de pointe de la pipette avec du PBS avec de la rhodamine B. Éviter la formation de bulles dans les réservoirs de pointes de pipettes, et d'éliminer toute bulle visible par pipetage de haut en bas. Détachez le tuyau de sortie et jeter de façon appropriée, puis insérez un réservoir de tubulure de sortie frais de recueillir le volume cible. 4. Caractériser la fréquence de croisement de cellules utilisant CDEP Chip Positionner la puce sur la platine d'un microscope inversé équipé d'un appareil photo numérique (figure 4). Figure 4. </strong> (a) expérimental pour l'ensemble des expériences CDEP. La puce CDEP se trouve sur la plate-forme du microscope inversé. Une caméra envoie des images à l'ordinateur pour l'enregistrement. La pompe à seringue maintient un débit d'entrée constant. Le générateur de fonction génère un signal qui est intensifié par l'amplificateur haute tension et relié à la puce CDEP par des électrodes en fil. L'oscilloscope surveille le signal envoyé à la puce. (B) Vue détaillée de la puce CDEP et connexions fluidiques et électroniques. Cliquez ici pour agrandir la figure . Monter la seringue sur le pousse-seringue et insérer des fils-électrodes dans fluidiques réservoirs du canal de l'électrode. Pomper le fluide à travers au 1 ml / h pour assurer un bon contact entre la pompe à seringue et la seringue. Inspecter visuellement la longueur du canal pour assurer une circulation sans entrave des cellules et l'absence de bulles ou de fuites. Rougedébit uce à 0,005 ml / h. Remarque: débit aussi élevé que 1 ml / h 31,35 a été réalisé dans des dispositifs d'autres géométries. Par mesure de sécurité, tester l'électronique par la mise sous tension du générateur de fonctions, un amplificateur de haute tension, et un oscilloscope, et de réglage de la tension et de la fréquence souhaitée. Ici, ces paramètres sont à 200 V et 20 kHz. Lors de la vérification de performance acceptable, la mise hors tension. Connecter les électrodes à l'amplificateur haute tension. Remarque: Respecter les consignes de sécurité électrique appropriées lors de l'utilisation de l'électronique dans les hautes tensions utilisées pour ces expériences. Après la réalisation de flux constant, appliquer la tension souhaitée à la fréquence désirée. Dans cette expérience, la tension est de 200 V RMS à des fréquences comprises entre 5 à 60 kHz. fichiers vidéo d'enregistrement de la réponse cellulaire à des techniques de traitement d'image (étape 5) pour quantifier la répartition des cellules dans le canal et de caractériser la fréquence de coupure. Pour ce faire,maintenir une tension constante et de faire varier la fréquence de façon systématique. Au début et à la fin de l'expérience, ainsi que de façon aléatoire entre les essais expérimentaux, enregistrer la répartition de cellules de contrôle, la répartition des cellules sans application de champ électrique. Estimer la quantité de temps nécessaire pour que les cellules à l'écoulement de l'entrée vers l'emplacement surveillé (ici, 5 min). Après avoir défini une nouvelle fréquence, attendre ce laps de temps, puis commencer à enregistrer (ici, une vidéo de 2 min de la distribution de la cellule). 5. Traitement de l'image pour caractériser la fréquence de croisement Utilisation d'un script de calcul, analyser chaque image vidéo, image par image afin de déterminer la position y relative (où la direction z est la profondeur verticale de la voie, la direction y est la largeur de canal et la direction x est la longueur de canal) de chaque cellule ou d'une particule fluorescente à une abscisse déterminée en aval de la région de la force DEP haut dans le canal. Créer un graphique de l'écran par rapportcontribution. Comparer la ligne médiane de la distribution, à chaque tension et la fréquence de la ligne médiane de la répartition de commande. Pour une tension donnée et des fréquences variables, déterminer la fréquence de transition, où l'axe correspond à la position y de la commande. 6. Varier l'expérience pour effectuer le tri de cellules ou d'enrichissement Suspension de mélange souhaité dans un tampon DEP à une concentration totale de 3 x 10 6 particules / ml. Ici, ce mélange est MOSE cellules-L avec 4 perles um fluorescents dans un tampon DEP. Suivez les étapes décrites précédemment pour préparer un dispositif CDEP. Pour trier ou enrichir des cellules à partir d'un mélange, déterminer les fréquences de coupure des cellules cibles et les particules de base comme décrit précédemment. Exploiter l'expérience à une fréquence entre les deux fréquences de coupure des cellules cibles et les particules de fond de sorte que les deux populations de particules subissent des forces DEP en face directions. Pour trier les cellules MOSE-L et 4 pm perles, utiliser le micro-dispositif ci-dessus 11.90 ± 0.63 kHz. la première fréquence de coupure de cellules MOSE-L récemment rapporté par Salmanzadeh et al 33. Pour récupérer le contenu d'un échantillon trié, retirer la tubulure de sortie lors de la collecte du volume cible, en plaçant un doigt de gant au-dessus de l'ouverture de sortie et en tirant doucement sur le tube. Verser le volume cible recueilli dans un réservoir pour une analyse ultérieure. Remarque: D'autres méthodes de récupération de l'échantillon pourraient inclure la fixation d'un réservoir permanent de la puce et de prélever l'échantillon par simple pipetage.

Representative Results

DEP doit être observée qualitativement dans le canal d'échantillon pour confirmer l'appareil est opérationnel lorsque le champ électrique est présent. Une méthode pour tester la présence de DEP est d'ajuster la fréquence à valeurs loin de la fréquence de transition, où une forte pDEP et nDEP sont prédites (à peu près> 40 kHz à observer pDEP et <10 kHz à observer nDEP pour la plupart des cellules cancéreuses de mammifère dans un un tampon ayant une conductivité de 100 uS / cm). Il convient de noter que les microsphères inertes présentent pDEP-dessous de leur fréquence de coupure et nDEP-dessus de leur fréquence de coupure. Pour la géométrie de la fonction en dents de scie présenté ici, pDEP devrait être considérée pour les cellules à la fréquence d'essai plus élevée, indiquée par l'apparition de la perle de chaînage et la focalisation des cellules ou des particules au bord de fonction en dents de scie de la chaîne, tout en fréquence de test inférieur, nDEP devrait être évident que les cellules sont restreintes à la région plus proche du bord droit de la voie. A ces basses fréquences, les cellules peuvent Lyse en raison de l'électroporation, de sorte que l'échantillon peuvent apparaître à contenir un nombre de cellules, et celles qui sont visibles peuvent apparaître élargie ou trouble si l'on utilise un colorant fluorescent activé par voie enzymatique. Vérification des fréquences auxquelles pDEP et nDEP se produisent permet de déterminer la fréquence de transition tel que décrit dans le protocole. Pour les cellules cancéreuses de mammifères, tels que-L MOSE utilisés ici, nous avons observé nDEP à 5 kHz (figure 5a) et une forte pDEP à 60 kHz (figure 5b). MOSE cellules-L avait un diamètre de 17,7 ± 3,3 um (n = 268 cellules) et les billes ont un diamètre nominal de 4 um. Une analyse complète des propriétés diélectriques de cellules MOSE-L par rapport aux cellules MOSE dans les premiers stades de progression peut être trouvé dans les travaux récents de Salmanzadeh et al. 33 Si pDEP et nDEP ne sont pas respectées à ces extrêmes, divers problèmes peuvent se produire. La conductivité de l'échantillon peut être trop élevée en raison de contaminants ou de lyse cellulaire. INSUFFISANTEnt champ électrique peut être généré en raison de bulles emprisonnées dans les canaux d'électrode de fluide, qui empêchent une conduction de courant pour la partie des canaux qui bordent le canal d'échantillon. Écoulement instationnaire peut être causée par une bulle piégée dans la seringue ou un tuyau d'entrée, des bulles résultant de ne pas garder le dispositif sous vide pendant une durée suffisante ou ne pas remplir rapidement le dispositif lors de l'enlèvement du vide, la fuite due au délaminage du PDMS faiblement liés à l' lame de verre, des larmes dans la membrane de barrière due à une force excessive exercée lors du remplissage des canaux, ou des débits aux extrémités de la plage de fonctionnement de la pompe. En plus de la détermination de la fréquence de séparation de cellules, cette technique peut être utilisée pour trier un mélange, illustré ici par un mélange de cellules MOSE-L et des perles. Cet exemple prend avantage de la diélectrophorèse négative (nDEP) présenté par 4 pm perles à des fréquences où les cellules MOSE-L éprouvent diélectrophorèse positive (pDEP). Nous operated l'appareil à 200 V RMS et 10 kHz (figure 6a) et a observé que les deux cellules et les billes ont été mélangés comme ils ont connu nDEP. A 50 kHz, nous avons observé le mouvement des cellules MOSE-L à la partie supérieure du canal, tandis que les billes ont été limités à la partie inférieure du canal, ce qui permet la séparation du mélange en deux composants (Figure 6b). Figure 5. La position des cellules MOSE-L est manipulée en changeant la fréquence du champ électrique appliqué. Les photos sont prises à la fonction en dents de scie finale dans le canal d'échantillon et les électrodes fluidiques sont situés au niveau des coins sur le côté droit. Ils sont remplis avec du PBS contenant de la rhodamine B, qui devient fluorescent pour visualiser les canaux. (A) des cellules MOSE-L expérience nDEP à 200 V RMS et 5 kHz. (b) des cellules MOSE-L expérience enchaînement de perles et pDEP à 200 V RMS et 60 kHz. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 6. Un mélange de cellules MOSE-L (vert) et de 4 um billes (rouge) s'écouler à travers la fonction en dents de scie finale dans le canal d'un dispositif de CDEP basse fréquence d'échantillonnage. (A) A 200 V et 10 cellules kHz et les perles sont mélangées. Les flèches indiquent apparaissant faiblement cellules qui probablement sont morts à cause des conditions de basse fréquence. (B) A 200 V et 50 cellules kHz expérience pDEP et se déplacent vers le bord de fonction du canal, tout en perles expérience nDEP et restent confinées à la région proche le bord droit.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.

Discussion

DEP est une technique puissante pour déterminer les propriétés diélectriques de particules et de diriger le mouvement des particules vers le tri des applications, l'isolement, ou d'enrichissement. En raison de l'effet néfaste de contact des électrodes directement auprès d'un échantillon, d'autres ont adopté des approches similaires à la méthode présentée précédemment pour éviter le contact. Par exemple, les dispositifs DEP libre de contact-Bashir et al. Développé en utilisant un dispositif microfluidique PDMS séparé de imprimées électrodes de la plaquette de circuit par une fine lamelle de verre, et cette technique est également disponible en format vidéo. ^23,36

Ici, nous avons montré la fabrication d'une puce CDEP fluidiques et des électrodes en utilisant un substrat de PDMS unique, et le protocole expérimental pour la séparation de cellules de cancer ovarien à partir d'un mélange de cellules et de billes fluorescentes. La technique présentée a été utilisé avec succès pour une variété d'applications plus complexes et physiologiquement pertinents, y compris le tri livcellules de e et mortes, ²⁸ tumeur initiant des cellules provenant des cellules de cancer de la prostate, ^{les 30} cellules cancéreuses à partir de cellules rouges du sang dilués, ^31,32 et la différentiation entre les stades du cancer du sein ³⁷ et le cancer de l'ovaire. ²⁹ CDEP a également été utilisé pour mélanger des particules ^38. Ces suggèrent que les applications en utilisant la technique simple présenté, diverses fins peuvent être réalisés simplement en modifiant la conception de la géométrie du canal.

. DEP est utile à l'échelle microscopique pour la manipulation de particules ¹³ Pour des particules sphériques, la force diélectrophorétique translation dépend des propriétés électriques et de la taille de la particule et son milieu de suspension, ainsi que le gradient du champ électrique au carré:

où ε _m est la constante diélectrique du milieu de suspension, r est le rayonde la particule, et Rc [k (ω)] est la partie réelle du facteur de Clausius-Mossotti (CM). Le facteur de CM est une mesure de la polarisabilité relative de la particule par rapport au milieu de mise en suspension et détermine la direction de la force diélectrophorétique. Il est décrit comme

où et sont les permittivités complexes de la particule et moyen, respectivement. La permittivité complexe, , Dépend de la conductivité (σ) et la fréquence (ω). Le facteur de CM de particules sphériques est théoriquement lié entre -0,5 et 1. Si le facteur de CM est négative, les particules subissent nDEP parce que le support est plus polarisable de la particule, de sorte que les particules de s'éloigner de régions d'gradients de champ électrique élevé. Si le facteur de CM est positive, les particules sont plus polarisables que le milieu et ils éprouvent pDEP dans laquelle elles se déplacent vers les régions de forts gradients de champ électrique.

Pour des particules biologiques qui sont non homogène dans la structure, comme des cellules, le facteur de Clausius-Mossotti peut être déterminée à partir d'une valeur effective pour la permittivité de particules:

où et sont la permittivité complexe de la permittivité complexe efficace de l'intérieur de la cellule, comme le cytoplasme, et la membrane plasmique, respectivement,. r est le rayon de la cellule, et d est l'épaisseur de la membrane plasmique ²⁶

Lorsque DEP se produit avec les particules en suspension dans unfluide, le mouvement de la particule par rapport au fluide va générer une force de traînée sur la particule. Cette force de traînée doit être considéré lors de la détermination de la force globale agissant sur la particule. Pour les situations qui nous intéressent ici, les forces visqueuses dominent et les particules sont supposées sphériques, petite, et se déplaçant avec une vitesse relativement faible, de sorte que la loi de traînée de Stokes fournit une bonne approximation de la force de traînée:

où η est la viscosité du fluide, u _p est la vitesse de la particule, et u _f est la vitesse du fluide, qui peut également être en mouvement. Compte tenu de la force diélectrophorétique, fluide et les propriétés des particules connues, et une vitesse d'écoulement connu, l'équilibre entre la force de traction et la force diélectrophorétique peut être résolu pour estimer la vitesse de la particule. Le taux de cisaillement que l'expérience des cellules doit être inférieur au seuil à partir duquel cell lyse peut se produire.

Caractérisation des propriétés électriques des particules est nécessaire de prévoir et de contrôler la façon dont ils vont réagir dans les PED. Dans ce travail, nous avons spécifiquement utilisés faible CDEP de fréquence avec des cellules MOSE-L pour démontrer le protocole pour déterminer la première fréquence de coupure de cellules, et ensuite montré tri continue de billes de polystyrène et des cellules MOSE-L sur la base de leurs réponses DEP opposées.

La modification de la géométrie du dispositif CDEP changera les gradients spatiaux du champ électrique, ce qui permet à des dispositifs conçus pour la haute fréquence ou de fonctionnement à basse fréquence, et pour une grande sélectivité et de l'efficacité de tri pour un type de cellule spécifié. En outre, des dispositifs à haut débit peuvent être développés par la fabrication des canaux plus larges, ³⁰ voies en parallèle, ou ³⁰ par la fabrication multicouche ^35, dans lequel les canaux d'électrode sont empilés verticalement au-dessus et au-dessous d'une relativement profondecanal d'échantillon. Membranes minces forment la barrière entre les couches. Les tests préliminaires dispositifs fabriqués en polyméthacrylate de méthyle (PMMA) et polycarbonate (PC) des films minces ont démontré réponse DEP de cellules MOSE-L. Les efforts actuels sont en cours pour affiner les dispositifs à haut débit multi-couches et d'améliorer le système périphérique vers une plate-forme plug-and-play éventuelle. Pour développer de la technique expérimentale de base présentée, les applications et les spécifications de l'appareil peuvent être adaptés aux exigences particulières, telles que le tri par rapport à la caractérisation, ou l'ajout de réservoirs d'échantillons et un système semi-automatique de l'appareil.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail soutenu a été soutenu en partie par la National Science Foundation Grant No. 0938047 EFRI, et par l'Institut Virginia Tech pour les technologies critiques et des sciences appliquées (ICTAS). Les auteurs tiennent à remercier le Dr Eva Schmelz et le Dr Paul Roberts pour leur don type de cellules MOSE-L. Les auteurs reconnaissent Angela Anderson pour son aide à la culture cellulaire, Caitlan Swaffar pour son aide avec l'édition de ce document et la préparation des expériences, et tous les membres du laboratoire Bioelectromechanical Systems.

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning, Midland, MI,USA	Sylgard 184
Glass slides	The Microscope Depot	76079	2×3 inch-ground edges
Microbore PTFE Tubing	Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA	EW-06417-31	Thin walled 20 gauge, 0.032″ID x 0.056″OD, 100 ft/roll
Luer-slip plastic syringes	National Scientific company	S7510-1
Needle tip	Howard Electronic instruments	JG20-1.0	20 Gauge 1.0″, ID=0.025″ OD=0.036″
D(+)-Sucrose	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S3-500
D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous	Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ	AC410955000
RPMI-1640 Medium	Quality Biological Inc.	112-025-101
Calcein AM, Molecular Probes	Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA	C3100MP	excitation wavelength 488/emission wavelength 516
Rhodamine B, O	Science Lab	SLR1465-100G	excitation wavelength 540/emission wavelength 625
Phosphate buffered saline (10X)	Gbiosciences, St. Louis, MO	RC-147
Leica, inverted light microscope	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	Leica DMI 6000B
Leica DFC420, color camera	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	Leica DFC420
Function generator	GW Instek, Taipei, Taiwan	GFG-3015
Wideband power amplifier	Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA	AL-50HF-A
HFHV Output Transformer		AL-T50-V25/300-F100K-600K
High voltage amplifier	Trek	Model 2205
USB Modular Oscilloscope, 100 MHz	AgilentTechnologies	U2701A
Expanded Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-001/002 (115/230V)	air plasma
Scotch Magic tape	3M		any available width is sufficient
1.5 mm puncher	Harris Uni-Core	Z708836-25EA
.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
FluoSpheres Sulfate Microspheres	Invitrogen	F8858	4.0 μm, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)
AZ 9260 photoresist	AZ Electronic Materials
AZ 400 K developer	AZ Electronic Materials
Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%			provided by Virginia Tech cleanroom
Teflon coating			applied using DRIE machine
Silicon wafer	University Wafer	452	100 mm diameter, 500 μm thickness, one side polished (SSP)
Deep Reactive Ion Etching (DRIE)	Alcatrel	AMS SDE 100

References

Butler, M. . Cell culture and upstream processing. , (2007).
Pratt, E. D., Huang, C., Hawkins, B. G., Gleghorn, J. P., Kirby, B. J. Rare Cell Capture in Microfluidic Devices. Chemical Engineering Science. 66, 1508-1522 (2011).
Salmanzadeh, A. D., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science and Technology. 3, e112 (2013).
Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. The Review of Scientific Instruments. 43, 404-409 (1972).
Adams, J. D., Kim, U., Soh, H. T. Multitarget magnetic activated cell sorter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18165-18170 (2008).
Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3191-3196 (2008).
Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18892-18897 (2007).
Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9, 3038-3046 (2009).
Grover, S. C., Skirtach, A. G., Gauthier, R. C., Grover, C. P. Automated single-cell sorting system based on optical trapping. J. Biomed. Opt. 6, 14-22 (2001).
Lin, S. C. S., Mao, X. L., Huang, T. J. Surface acoustic wave (SAW) acoustophoresis: now and beyond. Lab Chip. 12, 2766-2770 (2012).
Pethig, R. Review Article-Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, (2010).
Gascoyne, P. R. C., Wang, X. B., Huang, Y., Becker, F. F. Dielectrophoretic separation of cancer cells from blood. Ieee T. Ind. Appl. 33, 670-678 (1997).
Pohl, H. A. . Dielectrophoresis : the behavior of neutral matter in nonuniform electric fields. , (1978).
Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science. , (2012).
Markx, G. H., Talary, M. S., Pethig, R. Separation of Viable and Nonviable Yeast Using Dielectrophoresis. J. Biotechnol. 32 (94), 29-37 (1994).
Flanagan, L. A., et al. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 26, 656-665 (2008).
Labeed, F. H., Coley, H. M., Thomas, H., Hughes, M. P. Assessment of multidrug resistance reversal using dielectrophoresis and flow cytometry. Biophys. J. 85, 2028-2034 (2003).
Hoettges, K. F., et al. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Anal. Chem. 80, 2063-2068 (2008).
Lapizco-Encinas, B. H., Simmons, B. A., Cummings, E. B., Fintschenko, Y. Insulator-based dielectrophoresis for the selective concentration and separation of live bacteria in water. Electrophoresis. 25, 1695-1704 (2004).
Davalos, R. V., et al. Performance impact of dynamic surface coatings on polymeric insulator-based dielectrophoretic particle separators. Anal. Bioanal. Chem. 390, 847-855 (2008).
Gallo-Villanueva, R. C., Rodriguez-Lopez, C. E., Diaz-De-La-Garza, R. I., Reyes-Betanzo, C., Lapizco-Encinas, B. H. DNA manipulation by means of insulator-based dielectrophoresis employing direct current electric fields. Electrophoresis. 30, 4195-4205 (2009).
Shafiee, H., Caldwell, J. L., Sano, M. B., Davalos, R. V. Contactless dielectrophoresis: a new technique for cell manipulation. Biomed Microdevices. 11, 997-1006 (2009).
Park, K., Suk, H. J., Akin, D., Bashir, R. Dielectrophoresis-based cell manipulation using electrodes on a reusable printed circuit board. Lab Chip. 9, 2224-2229 (2009).
Jen, C. P., Maslov, N. A., Shih, H. Y., Lee, Y. C., Hsiao, F. B. Particle focusing in a contactless dielectrophoretic microfluidic chip with insulating structures. Microsyst Technol. 18, 1879-1886 (2012).
Hughes, M. P. AC electrokinetics: applications for nanotechnology. Nanotechnology. 11, 124-132 (2000).
Pethig, R. Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, 022811 (2010).
Pethig, R., Ferrari, M. a. u. r. o., Ozkan, M. i. h. r. i. m. a. h., Heller, M. i. c. h. a. e. l. . J. .. Ch. 4. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. 4, 103-126 (2007).
Shafiee, H., Sano, M. B., Henslee, E. A., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Selective isolation of live/dead cells using contactless dielectrophoresis (cDEP). Lab Chip. 10, 438-445 (2010).
Salmanzadeh, A., et al. Dielectrophoretic differentiation of mouse ovarian surface epithelial cells, macrophages, and fibroblasts using contactless dielectrophoresis. Biomicrofluidics. 6, (2012).
Salmanzadeh, A., et al. Isolation of prostate tumor initiating cells (TICs) through their dielectrophoretic signature. Lab Chip. 12, 182-189 (2012).
Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M., Davalos, R. V. Isolation of Rare Cancer Cells from Blood Cells Using Dielectrophoresis. , (2012).
Sano, M. B., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Modeling and development of a low frequency contactless dielectrophoresis (cDEP) platform to sort cancer cells from dilute whole blood samples. Biosens. Bioelectron. 30, 13-20 (2011).
Salmanzadeh, A., et al. Investigating Dielectric Properties of Different Stages of Syngeneic Murine Ovarian Cancer Cells. Biomicrofluidics. , (2013).
Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M. A., Davalos, R. V. . , 590-593 (2012).
Sano, M. B., Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations. Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).
Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar. J. Vis. Exp. (48), e2545 (2011).
Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).
Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).

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Elvington, E. S., Salmanzadeh, A., Stremler, M. A., Davalos, R. V. Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis. J. Vis. Exp. (79), e50634, doi:10.3791/50634 (2013).

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