Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Elizabeth S. Elvington; Alireza Salmanzadeh; Mark A. Stremler; Rafael V. Davalos

doi:10.3791/50634

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Medicine

Label-free Isolatie en Verrijking van cellen door contactloze Dielectrophoresis

Published: September 03, 2013

doi:

10.3791/50634

Elizabeth S. Elvington¹, Alireza Salmanzadeh^1,2, Mark A. Stremler^1,2, Rafael V. Davalos^1,2

¹School of Biomedical Engineering and Science,Virginia Tech, ²Department of Engineering Science and Mechanics,Virginia Tech

Summary

Contactloze dielectrophoresis (cDEP) realiseert sorteren en verrijking van deeltjes via hun intrinsieke diëlektrische eigenschappen. Fluidisch elektrode kanalen vervangen metalen elektroden traditioneel tot DEP, die voldoet cDEP om niet-schadelijke steriel karakterisering en het sorteren van de biologische deeltjes. We laten zien hoe je een cDEP microdevice bereiden en uit te voeren cel karakterisering en sorteren experimenten.

Abstract

Diëlektroforese (DEP) is het verschijnsel waarbij gepolariseerde deeltjes in een niet-uniform elektrisch veld onderworpen translatiebeweging, en kunnen met behulp waarvan de beweging van microdeeltjes in een oppervlak marker-onafhankelijke wijze. Traditioneel, DEP apparaten zijn vlakke metalen elektroden gevormd in de steekproef kanaal. Deze aanpak kan duur zijn en vereist een gespecialiseerde cleanroom omgeving. Onlangs is een contactloze aanpak genaamd contactloze dielectrophoresis (cDEP) ontwikkeld. Deze methode maakt gebruik van het klassieke principe van DEP terwijl het vermijden van direct contact tussen de elektroden en het monster door patroonvorming vloeibare elektroden en een monster kanaal uit een enkele polydimethylsiloxaan (PDMS) substraat, en vindt toepassing als een snelle microfluïde strategie ontwikkeld om te sorteren en te verrijken microdeeltjes. Uniek aan deze methode is dat het elektrisch veld wordt opgewekt via vloeibare elektrode kanalen met een goed geleidend fluïdum, die zijn gescheiden van demonsterkanaal door een dunne isolerende barrière. Omdat metalen elektroden niet direct contact met het monster, elektrolyse, elektrode delaminatie, en vervuiling monster worden vermeden. Bovendien, dit maakt een goedkope en eenvoudige fabricageproces.

cDEP is dus zeer geschikt voor het manipuleren van kwetsbare biologische deeltjes. De diëlektroforetische kracht die op de deeltjes niet alleen afhangt ruimtelijke gradiënten van het elektrisch veld dat door klantgerichte ontwerp van de geometrie inrichting, maar de intrinsieke biofysische eigenschappen van de cel. Als zodanig, cDEP is een label-free techniek die vermijdt afhankelijk van het celoppervlak uitgedrukte moleculaire biomarkers die variabel kan worden uitgedrukt in een populatie, terwijl u toch de karakterisering, verrijking, en sorteren van bioparticles.

Hier tonen we de basis van fabricage en experimenteren met behulp cDEP. We leggen de eenvoudige bereiding van een cDEP chip met behulp van zachte lithografiey technieken. We bespreken de experimentele procedure voor de bepaling kantelfrequentie van een deeltje of cel, de frequentie waarmee de diëlektroforetische kracht nul. Tenslotte tonen we het gebruik van deze techniek voor het sorteren van een mengsel van eierstokkanker cellen en fluorescerende microbolletjes (korrels).

Introduction

Biologisch monster verrijking en deeltjes sorteren is vaak nodig voor daaropvolgende analyse. ¹ bijvoorbeeld isolatie van zeldzame cellen uit lichaamsvloeistoffen heeft belangrijke toepassingen in de opsporing en geïndividualiseerde geneeskunde. ^2,3 De meest gebruikte verrijkingstechnieken fluorescerende geactiveerde celsortering (FACS ) ⁴ en magnetisch geactiveerde celsortering (MACS), ⁵ die steunen op expressie oppervlaktemerkers cellen differentiëren. Andere strategieën omvatten hydrodynamische ⁶ of inertiale ^7,8 sorteren, optisch pincet, acoustophoresis ^{9, 10} en dielectrophoresis. ^11,12 Dielectrophoresis is de beweging van een gepolariseerde deeltje in aanwezigheid van een niet-uniform elektrisch veld. Is ¹³ DEP gebruikt voor een breed scala van toepassingen, ^2,14 inclusief sorteren cellen op basis van levensvatbaarheid, ¹⁵ karakteriseren van bio-elektrische eigenschappen van cellen, ¹⁶ en sorterenkelijk van geïnduceerde veranderingen in biofysische eigenschappen van cellen. ^17,18 Traditionele DEP gebruikt vlakke elektroden gevormd binnen een microfluïdische kanaal een spanning op en leiden tot een niet-uniforme elektrische veld. ¹³ Hoewel dit een krachtige techniek, kunnen problemen ontstaan, zoals elektrode delaminatie en elektrolyse. Isolator-gebaseerde dielectrophoresis (IDEP) ¹⁹ is ingegaan op de uitdagingen van de vervuiling, elektrode delaminatie, en ruimtelijke aantasting van het gebied elektrode door patroonvorming isolerende structuren die ongelijkmatigheden induceren in een DC-elektrisch veld. Idep is gebruikt om levende en dode bacteriecellen selectief scheiden, isoleren bacteriële sporen ^{19, 20} en manipuleren van DNA, ²¹ onder andere toepassingen. Joule verwarming kan een uitdaging omdat het kan optreden als gevolg van de hoge DC-spanningen vaak nodig. Om deze uitdagingen te verbeteren, hebben contactloze DEP Microdevices ontwikkeld. ^22-24

<p class = "jove_content"> De hier gepresenteerde techniek maakt gebruik van contactloze dielectrophoresis (cDEP), zo genoemd naar het gebrek aan direct contact tussen metalen elektroden en het monster kanaal. ²² Uniek aan deze strategie is de vervanging van metalen elektroden met vloeistof elektrode kanalen gevuld met een sterk geleidende oplossing. Deze vloeistof elektroden zijn capacitief gekoppeld over een dunne isolerende barrière voor het monster-kanaal via een wisselspanning. Het wegwerken monster contact met elektroden vermindert kwesties in verband met DEP-gebaseerde methoden zoals elektrolyse en belvorming, monsterverontreiniging en elektrode delaminatie. Hierdoor cDEP is vooral nuttig voor biologische monsters want het ondersteunt levensvatbaarheid van de cellen in het monster. Belangrijk is, kan cDEP monster steriliteit te behouden. Een chip kan worden bereid in een celcultuur motorkap en het experiment kan worden uitgevoerd zonder dat monster contact met metalen elektroden of te eisen dat het monster open voor de environment. Een eenvoudige reservoir kan worden bevestigd aan de chip stopcontact om steriele monster herstel te bevorderen. Bovendien is de fabricage van fluïdum elektroden van dezelfde biocompatibel polymeer materiaal (PDMS) als monster kanaal vermindert de hoge kosten die met aangepaste patroonvorming van metalen elektroden, de tijd die nodig is voor de productie en beperkt de behoefte aan gespecialiseerde cleanroom apparatuur om de oorspronkelijke patronen van de herbruikbare silicium wafer stempel.

Beweging van deeltjes door DEP afhankelijk van de kenmerken van het deeltje en het medium, en de ruimtelijke gradiënten van het elektrische veld. Een deeltje-en frequentie-afhankelijke factor, genaamd de Clausius-Mossotti (CM) factor met een waarde in het bereik -0,5 tot 1, en bepaalt de richting van de DEP-kracht. De frequentie waarmee de CM factor is precies nul is de crossover-frequentie genoemd. Dit is het punt waarop geen diëlektroforetische kracht wordt uitgeoefend op een deeltje en de CM factor tekenwisselingen. A sIngle crossover frequentie voor inerte vaste microsferen treedt op wanneer de CM factor verandert van negatief naar positief ²⁵ Voor zoogdiercellen in lage geleidbaarheid buffer in de orde van 0,01 S / m, een eerste crossover-frequentie duidt op een overgang van nDEP naar pDEP bestaat buurt van 10. – 100 kHz, en wordt beïnvloed door de grootte, vorm, cytoskelet en membraan eigenschappen van de cel. ^26,27 Een tweede cross frequentie verschuiving van de pDEP tot nDEP regeling in de orde van 10 MHz, en wordt beïnvloed door de ²⁷ DEP kracht kan worden toegepast kern-cytoplasma verhouding, geleidbaarheid cytoplasma en endoplasmatisch reticulum. niet aanwezig fluïdumstroom, maar hier gebruiken we een stromend fluïdum continu sorteren van zwevende deeltjes te bereiken. De gecombineerde invloed van de diëlektroforetische kracht en de Stokes 'drag kracht dicteren de translationele beweging van een deeltje.

We hebben inrichtingen voor gebruik ontwikkeld in twee frequentiebereiken. Hogere frequency inrichtingen (100-600 kHz) zijn uitgevoerd met pDEP en bereikte batch sorteren van cellen, zoals prostaat-tumor-initiërende cellen (TIC) van muis ovariële oppervlakte epitheel (MOSE) cellen, MDA-MB-231 borstkankercellen, of live THP -1 cellen door selectief vangen cellen van belang op isolerende berichten in de steekproef kanaal. ^28-31 Lagere frequentie (5-100 kHz) apparaten werken continu, en wanneer werkt bij een frequentie waarop een bevolking ervaart pDEP terwijl de achtergrond bevolking ervaringen nDEP kan deeltjestrajecten omleiden bereiken sorteren. ^32-34 Deze laagfrequente inrichtingen zijn gebruikt om kankercellen te sorteren uit rode bloedcellen, bepalen de veranderingen in diëlektrische eigenschappen van een progressieve MOSE cellijn, en de effecten van niet-helderen giftige sfingolipide behandelingen op het omkeren van agressieve kenmerken van agressieve MOSE cellen. Bovendien kan cDEP microdevices worden ontworpen om te werken bij een snellere doorvoer, momenteel tot 1 ml / hr. ^31,35

Zoals beschreven, de flexibiliteit en lage kosten van het fabricageproces mogelijk maakt ontworpen apparaat geometrieën, waardoor de gepresenteerde experimentele procedure toepassing voor uiteenlopende toepassingen. De lange-termijn doel van cDEP is om label-free cel sortering en verrijking van een klinisch niveau te realiseren, met het monster herstel voor verdere cultuur of verwerking. De hier gepresenteerde techniek is een eenvoudige en goedkope methode van fabricage tot experimenten die de toegankelijkheid van DEP toeneemt. We tonen de voorbereiding van een cDEP chip en de experimentele protocol om karakterisering en verrijking van eierstokkanker cellen van fluorescerende microsferen bereiken.

Protocol

1. Vervaardigen van een prototype cDEP Microfluidic Device: Overzicht Volg eerder beschreven procedures 22 met fotolak en Deep Reactive Ion Etching (DRIE) om het gewenste kanaal ontwerp (figuur 1) in een silicium wafer (figuur 2) te etsen. Stort een dun laagje Teflon om de vrijlating van de microdevice uit de wafer te verbeteren. Figuur 1. Schematische voorstelling van een lage frequentie continue sorteerinrichting. Het monster kanaal loopt van links naar rechts en is 500 micrometer breed met zaagtand vernauwingen tot 100 urn. De twee paren vloeibare elektrode kanalen samen de storingsbron en elektroden, respectievelijk, en uit het monster kanaal zijn gescheiden door een 20 pm dikke PDMS barrière. Figuur 2. De fabricatie werkwijze een cDEP inrichting. (a) voor 60 sec, UV-licht selectief reageert met fotolak belicht door een maskerpatroon van de geometrie inrichting cDEP. (b) fotoresist wordt verwijderd met ontwikkelaar. (c) Deep Reactive Ion Etching (DRIE) wordt gebruikt voor het etsen 50 urn diep functies en 5 minuten van natte ets van tetramethylammoniumhydroxide (TMAH) 25% bij 70 ° C wordt gebruikt om ruwheid te verminderen op de zijwanden. (d) een teflon coating wordt toegevoegd aan inrichting afgifte uit verbeteren de wafer. (e) PDMS wordt uitgegoten in de herbruikbare wafer stempel na ontgassen en uitgehard gedurende 45 minuten bij 100 ° F (f) PDMS wordt uit de wafel. PDMS en een schoon glasplaatje worden blootgesteld aan luchtplasma gedurende 2 minuten en met elkaar verbonden. Wikkel de wafer met aluminiumfolie om spill-over te voorkomen. Meng polydimethylsiloxaan (PDMS) in 10:01 verhouding van elastomeer verharder, de-gas voor ongeveer 20 minEn giet op de wafer. Warmte gedurende 45 minuten op 100 ° C om te voorkomen beschadiging van de Teflon coating van de stempel. Laat het apparaat afkoelen. Na afkoelen verwijderen aluminiumfolie, trim PDMS met een chirurgisch mes, en punch toegangsopeningen op kanaal inlaat / uitlaat met een stomp perforator geschikt voor de omvang van de slang. Hier wordt een 1,5 mm stomp puncher gebruikt. Reinig een glazen objectglaasje met behulp van een spoeling met water en zeep, ethanol, DI-water, en drogen met lucht, respectievelijk. Reinig het PDMS apparaat met behulp van Scotch Magic tape. Onderzoek onder de microscoop om zeker kanalen schoon zijn. Expose de glijbaan en PDMS apparaat om lucht plasma gedurende 2 minuten. Druk stevig op kanaal zijkant van het toestel om glasplaatje, het vermijden van de vorming van luchtbellen tussen het apparaat en de glijbaan (figuur 3). Figuur 3. </strong> (a) Het masker wordt gebruikt voor fotolithografie tijdens de silicium wafer stempel fabricage, en (b) de afgewerkte PDMS-glas apparaat met het monster en vocht elektrode kanalen gevuld met groene en rode kleurstof, respectievelijk. Zie Figuur 1 voor de afmetingen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . 2. Het voorbereiden van een celsuspensie in DEP Buffer Bereid een lage geleidbaarheid (100 uS / cm) buffer, die zal worden aangeduid als "DEP buffer" (8,5% sucrose [w / v], 0,3% glucose [w / v], 0,725% RPMI [w / v]) . 16 Suspendeer cellen in DEP buffer bij 3 x 10 6 cellen / ml. Hier worden kanker laat stadium muis ovariële oppervlakte epitheel (MOSE-L) cellen gebruikt. Opmerking: Cel levensvatbaarheid analyse door trypan blauwe kleurstof uitsluiting werkwijze een lichte daling van de levensvatbaarheid(95,1-91,6%) van de vroege stadia MOSE (MOSE-E) cellen gesuspendeerd in DEP buffer bij kamertemperatuur na 5 uur. Het is voorspeld dat een soortgelijk lichte daling in levensvatbaarheid komt voor MOSE-L-cellen, wat aangeeft dat de cellen niet worden opgeslagen in DEP buffer lange termijn. Dye cellen met een fluorescente membraan-permeabele kleurstof, zoals enzymatisch actieve Calcein AM. Meet geleidbaarheid van de geverfde celsuspensie. De geleidbaarheid moet ongeveer 100 mS / cm zijn. Als de geleidbaarheidsmeting te hoog, draaien het monster af, resuspendeer in DEP buffer bij 3 x 10 6 cellen / ml en herhaal de geleidbaarheidsmeting. 3. Het laden van de cDEP Microfluidic Chip Plaats de microfluïdische chip onder vacuüm gedurende 30 minuten. Snijd ondertussen een stuk flexibele buis aan de afstand tussen de spuitpomp overspannen de microscoop stadium waarin de microfluïdische chip bevinden. Hier, een 6 inch lengte van de buisvereist. Fit slang aan tip naald op spuit. Schat de gewenste lengte voor afvoer slang door het doel verzamelde monstervolume delen door de dwarsdoorsnede van de buis. Snijd de eisen lengte van de buis. Trekken celsuspensie in spuit. Controleer dat er geen luchtbellen in de buis of spuit. Bij het verwijderen van chip van vacuüm, plaatst de uitlaat buizen en prime het monster kanaal snel om ingesloten luchtbellen in de kanalen te voorkomen. Tik zachtjes tegen de spuit wanneer priming om te voorkomen dat scheuren van de dunne (20 um) isolerende barrière, maar het is waargenomen dat de barrière een constante hoge doorvoer in de buurt 5 ml / uur kan weerstaan zonder te scheuren. Prime de elektrode kanalen, snel te plaatsen lege pipet tips in een uitlaat van elke vloeibare elektrode kanaal. Pipetteer 200 ul van PBS dat een kleine hoeveelheid rhodamine B en tik zachtjes om de vloeistof te introduceren in het andere uiteinde van de elektrode kanaal. Handhaaf zachte druktot PBS met rhodamine B vordert zienderogen de punt van de lege pipet tip. Herhaal dit voor elke elektrode kanaal. Rhodamine B wordt alleen gebruikt om fluorescent visualiseren de vloeibare elektrode kanalen. Na priming, vul elk pipettip reservoir met PBS met rhodamine B. vorming Vermijd zeepbel in de pipet tip reservoirs, en verwijder zichtbare bubble door pipetteren zachtjes op en neer. Maak de uitlaat slang en gooi op de juiste wijze, dan plaatst u een nieuwe uitlaat slang reservoir aan het doelvolume te verzamelen. 4. Karakteriseren crossover-frequentie van cellen met behulp cDEP Chip Plaats de chip op het podium van een omgekeerde microscoop uitgerust met een digitale camera (figuur 4). Figuur 4. </strong> (a) Algemene experimentele opstelling voor cDEP experimenten. De cDEP chip is op het platform van het omgekeerde microscoop. Een camera stuurt beelden naar de computer voor het opnemen. De spuitpomp een constante inlaat stroom. De functiegenerator genereert een signaal dat maximaal wordt versterkt door de hoge spanning versterker en met de cDEP chip per draad elektroden. De oscilloscoop controleert het signaal dat naar de chip. (B) Detail weergave van de cDEP chip en vloeibare en elektronische verbindingen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Monteer spuit op injectiepomp en steek draad elektroden in vloeibare elektrode kanaal reservoirs. Pomp fluïdum door 1 ml / uur om een goed contact tussen de spuitpomp en de spuit te waarborgen. Inspecteer de kanaal lengte tot ongehinderde stroom van cellen en de afwezigheid van bellen of lekkages te garanderen. Rooduce debiet tot 0,005 ml / uur. Opmerking: Throughput zo hoog als 1 ml / uur 31,35 is bereikt in apparaten van andere geometrieën. Voor de veiligheid, het testen van de elektronica door het inschakelen van de functie generator, hoogspanning versterker en oscilloscoop, en aan te passen aan de gewenste spanning en frequentie. Hier deze parameters zijn 200 V en 20 kHz. Na verificatie van acceptabele prestaties, stroom uit. Sluit elektroden hoogspanning versterker. Opmerking: Let op de juiste elektrische veiligheid procedures bij het bedienen van de elektronica bij de hoge voltages gebruikt voor deze experimenten. Bij een gestage stroom, passen de gewenste spanning op de gewenste frequentie. In dit experiment spanning 200 V RMS bij frequenties tussen 5-60 kHz. Record videobestanden van de cel respons met beeldverwerking technieken (stap 5) om celverdeling kwantificeren in het kanaal en de crossover-frequentie te karakteriseren. Om dit te doen,handhaven van een constante spanning en variëren de frequentie systematisch. Aan het begin en einde van het experiment, en willekeurig tussen experimentele runs, nemen de controle celverdeling, de verdeling van de cellen zonder dat er een elektrisch veld. Schat de hoeveelheid tijd die cellen stroomt van de inlaat naar de bewaakte locatie (hier, 5 min). Na het instellen van een nieuwe frequentie, wacht dit bedrag van de tijd, dan beginnen met opnemen (hier, een 2 minuten video van celverdeling). 5. Beeldverwerking voor het karakteriseren van Crossover Frequency Met een computationele script analyseren elk videoframe frame de relatieve Y-positie (waarbij de z-richting is de verticale diepte van het kanaal, de y-richting is de kanaalbreedte en x-richting is de kanaallengte) te bepalen elke fluorescerende cellen of deeltjes op een bepaalde x-coordinaat stroomafwaarts van het gebied van hoge DEP-kracht in het kanaal. Een grafiek van de relatieve disbijdrage. Vergelijk de hartlijn van de verdeling op iedere spanning en frequentie van de hartlijn van de controle distributie. Voor een gegeven spanning en verschillende frequenties, bepaalt de scheidingsfrequentie, waarbij de middellijn overeenkomt met de y-positie van de controle. 6. Het variëren van de Experiment to Cell Sorting of Verrijking Perform Suspendeer gewenste mengsel DEP buffer bij een totale concentratie van 3 x 10 6 deeltjes / ml. Hier, dit mengsel MOSE-L cellen met 4 micrometer fluorescerende kralen in DEP buffer. Voer de eerder beschreven stappen om cDEP apparaat voor te bereiden. Sorteren of verrijken cellen van een mengsel bepalen de crossover frequentie van de doelcellen en de achtergrond deeltjes zoals eerder beschreven. Gebruik het experiment bij een frequentie tussen de twee crossover frequenties van de doelcellen en de achtergrond deeltjes zodat de twee populaties deeltjes ervaren DEP krachten tegengesteld directions. Om MOSE-L cellen en 4 micrometer kralen sorteren, werken de microdevice boven 11,90 ± 0,63 kHz. de eerste crossover-frequentie van MOSE-L-cellen onlangs gemeld door Salmanzadeh et al.. 33 Om de inhoud van een gesorteerde monster verzamelen, verwijder de uitlaat slang op het verzamelen van het doelvolume, door het plaatsen van een handschoen vinger over de uitstroomopening en voorzichtig trekken aan de slang. Giet de verzamelde doelvolume in een reservoir voor verdere analyse. Opmerking: Andere sample recovery-methoden kunnen onder andere het aanbrengen van een permanent reservoir aan de chip en het monster te verwijderen door eenvoudige pipetteren.

Representative Results

DEP moet kwalitatief worden waargenomen in het monsterkanaal bevestigen de inrichting operationeel wanneer het elektrisch veld aanwezig is. Een methode om te testen op de aanwezigheid van DEP is de frequentie waarden ver van de scheidingsfrequentie waar sterke pDEP en nDEP voorspeld (ruwweg> 40 kHz en pDEP <10 kHz tot nDEP observeren meeste zoogdierlijke kankercellen in een acht buffer met een geleidbaarheid van 100 uS / cm). Opgemerkt zij dat inert microbolletjes vertonen pDEP onder hun scheidingsfrequentie en nDEP boven hun kantelfrequentie. Voor de zaagtand functie geometrie hier gepresenteerd, moet pDEP worden gezien voor cellen in de hogere meetfrequentie aangegeven door het optreden van de parel chaining en het focussen van cellen of deeltjes in de zaagtand functie rand van het kanaal, terwijl bij de lagere meetfrequentie nDEP duidelijk dient als cellen beperkt tot het gebied dichter bij de rechte rand van het kanaal. Bij deze lage frequenties, kunnen cellen Lyse door elektroporatie, zodat het monster lijkt minder cellen bevatten, en die toegankelijk zijn verschijnen vergroot of wazig bij gebruik van een enzymatisch geactiveerd fluorescerende kleurstof. Controle van de frequenties waarop pDEP en nDEP optreden maakt de bepaling van de wisselfrequentie zoals beschreven in het protocol. Voor zoogdierlijke kankercellen, zoals MOSE-L hier gebruikte namen wij nDEP op 5 kHz (figuur 5a) en sterke pDEP bij 60 kHz (figuur 5b). MOSE-L cellen hadden een diameter van 17,7 ± 3,3 um (n = 268 cellen) en de kralen hebben een 4 urn nominale diameter. Een volledige analyse van de diëlektrische eigenschappen van MOSE-L-cellen ten opzichte van MOSE cellen in eerdere stadia van progressie is te vinden in het recente werk van Salmanzadeh et al.. 33 Als pDEP en nDEP niet worden waargenomen bij deze extremen kunnen verschillende problemen worden voorkomen. Het monster geleidbaarheid te hoog als gevolg van verontreinigingen of cellyserende zijn. ONVOLDOENDnt elektrisch veld kan worden opgewekt door luchtbellen gevangen in de vloeistof elektrode kanalen, die geleiding van stroom aan het deel van het kanaal grenzend aan het monster kanaal voorkomen. Stationaire stroming kan worden veroorzaakt door een luchtbel gevangen in de injectiespuit of inlaatslang, bellen veroorzaakt door het niet houden van de inrichting onder vacuüm gedurende een voldoende tijd of niet snel vullen van de inrichting op het verwijderen van vacuüm lekkage door delaminatie van slecht gebonden PDMS het glasplaatje, tranen in de barrière membraan als gevolg van overmatige kracht die wordt uitgeoefend bij het vullen van de kanalen, of debieten aan de uiteinden van de pomp werkbereik. Naast het bepalen van de scheidingsfrequentie cellen, kan deze techniek worden gebruikt om een mengsel, hier geïllustreerd door een mengsel van MOSE-L cellen en kralen sorteren. Dit voorbeeld maakt gebruik van de negatieve dielectrophoresis (nDEP) tentoongesteld door 4 micrometer kralen bij frequenties waar MOSE-L-cellen ervaren positieve dielectrophoresis (pDEP). We operated het apparaat bij 200 V RMS en 10 kHz (figuur 6a) en merkte op dat beide cellen en kralen werden gemengd als ze ervaren nDEP. Bij 50 kHz namen wij verkeer van MOSE-L cellen aan de bovenkant van het kanaal, terwijl parels werden beperkt tot het onderste gedeelte van het kanaal, waardoor scheiding van het mengsel in twee delen (figuur 6b). Figuur 5. De positie van MOSE-L cellen wordt gemanipuleerd door de frequentie van het aangelegde elektrische veld verandert. De foto's zijn genomen in het laatste zaagtand kenmerk in het monster kanaal en de vloeibare elektroden zijn gelegen op de hoeken aan de rechterkant. Ze zijn gevuld met PBS dat rhodamine B, die fluoresceert de kanalen visualiseren. (A) MOSE-L cellen ervaren nDEP bij 200 V RMS en 5 kHz. (b) MOSE-L-cellen ervaren parel chaining en pDEP bij 200 V RMS en 60 kHz. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Figuur 6. Een mengsel van MOSE-L cellen (groen) en 4 urn kralen (rood) stromen door de laatste zaagtand kenmerk in het monster kanaal van een laagfrequente cDEP apparaat. (A) Aan 200 V en 10 kHz cellen en korrels gemengd. Pijlen wijzen naar vaag te zien zijn cellen die waarschijnlijk zijn overleden als gevolg van de lage frequentie voorwaarden. (B) Bij 200 V en 50 kHz cellen ervaren pDEP en te verplaatsen naar de functie rand van het kanaal, terwijl de kralen ervaren nDEP en blijven beperkt tot de regio dichterbij de rechte rand.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Discussion

DEP is een krachtige techniek voor het bepalen van de diëlektrische eigenschappen van de deeltjes en de leiding deeltjes beweging naar sorteren, isolatie of verrijking toepassingen. Door het schadelijke effect van direct contact elektrode met een monster, anderen benadering gelijk aan de eerder gepresenteerde methode om contact te vermijden genomen. Bijvoorbeeld, Bashir et al.. Ontwikkelde contactloze DEP apparaten met behulp van een microfluïdische PDMS apparaat gescheiden van printplaat elektroden door een dunne glazen dekglaasje, en deze techniek is ook beschikbaar in video-formaat gemaakt. ^23,36

Hier hebben we aangetoond de fabricage van een cDEP chip en vloeibare elektrodes met een PDMS substraat en de experimentele protocol voor het scheiden ovariale kankercellen uit een mengsel van cellen en fluorescerende kralen. De gepresenteerde techniek is met succes toegepast voor een verscheidenheid aan meer complexe en fysiologisch relevante toepassingen, waaronder sorteren live en dode cellen, ²⁸ tumor-initiërende cellen van prostaatkankercellen, ³⁰ kankercellen uit verdunde rode bloedcellen, ^31,32 en differentiëren tussen stadia van borstkanker ³⁷ en eierstokkanker. cDEP ²⁹ is ook gebruikt voor het mengen van deeltjes. Deze ³⁸ aanvragen suggereren dat door de eenvoudige techniek gepresenteerd uiteenlopende doeleinden kunnen eenvoudig volbracht door het veranderen van het ontwerp van het kanaal geometrie.

. DEP is nuttig op microschaal voor het manipuleren van partikels ¹³ voor bolvormige deeltjes, de translationele diëlektroforetische kracht afhankelijk van de grootte en elektrische eigenschappen van het deeltje en het suspensiemedium, evenals het verloop van het elektrische veld kwadraat:

waarin ε _m de permittiviteit van het suspensiemedium, r de straalvan het deeltje, en R [k (ω)] is het reële deel van de Clausius-Mossotti (CM) factor. De CM factor is een maat voor de relatieve polariseerbaarheid van het deeltje ten opzichte van het suspenderende medium en bepaalt de richting van de diëlektroforetische kracht. Het wordt beschreven als

waar en zijn de complexe permittiviteit van het deeltje en medium, respectievelijk. Het complex permittiviteit, , Afhankelijk geleidingsvermogen (σ) en frequentie (ω). De CM factor bolvormige deeltjes theorie gebonden tussen -0,5 en 1. Indien de CM factor negatief is, de deeltjes ondervinden nDEP omdat het medium meer polariseerbaar dan het deeltje, zodat deeltjes verder weg van gebieden vanhoog elektrisch veld gradiënten. Als de CM factor is positief, de deeltjes zijn meer polariseerbaar dan de medium en zij ervaren pDEP waarin ze bewegen in de richting van de regio's van hoge elektrische veld gradiënten.

Voor biologische deeltjes die zijn homogene structuur, zoals cellen, kan de Clausius-Mossotti factor bepaald bij een effectieve waarde voor de diëlektrische deeltjes:

waar en zijn complexe permittiviteit van de effectieve complex permittiviteit van het inwendige van de cel, zoals het cytoplasma en de plasmamembraan, respectievelijk. r de straal van de cel, en d de dikte van het plasmamembraan ²⁶

Bij DEP optreedt met deeltjes die in eenvloeistof, zal de beweging van het deeltje ten opzichte van het fluïdum een sleepkracht op het deeltje te genereren. Deze wrijving moet worden overwogen bij het bepalen van de totale kracht die op het deeltje. Voor de situaties van belang hier, viskeuze krachten domineren en deeltjes bolvormig, klein, en bewegen met relatief lage snelheid aangenomen, dus Stokes 'drag wet voorziet een goede benadering voor de wrijvingskracht:

waarbij η de viscositeit van het fluïdum, u _p de snelheid van het deeltje, en U _f de snelheid van het fluïdum, die ook kan bewegen. Gezien de diëlektroforetische kracht, bekend vloeistof en deeltjes eigenschappen, en een bekende stroomsnelheid, kan de balans tussen de wrijvingskracht en de diëlektroforetische kracht worden opgelost te schatten de deeltjessnelheid. De afschuifsnelheid dat de cellen ervaring moet onder de drempel waarbij cell lyseren kan optreden.

Karakterisering van de elektrische eigenschappen van deeltjes moet voorspellen en bepalen hoe zij onder DEP reageren ze. In dit werk, wij specifiek laagfrequent cDEP met MOSE-L-cellen gebruikt om het protocol aan te tonen voor het bepalen van de eerste crossover-frequentie van cellen, en vervolgens liet continue sorteren van polystyreen korrels en MOSE-L-cellen op basis van hun tegengestelde DEP reacties.

Veranderen van de geometrie van het apparaat cDEP de ruimtelijke gradiënten van het elektrische veld te veranderen, waardoor apparaten zijn ontworpen voor hoge of lage frequency en voor hoge selectiviteit en efficiëntie sorteren voor een bepaalde celtype. Bovendien kunnen hoge doorvoer apparaten worden ontwikkeld vervaardigen bredere kanalen, ³⁰ kanalen parallel, ³⁰ of meerlagige fabricage ^35, waarbij de elektrode kanalen verticaal gestapeld boven en onder een relatief diepemonsterkanaal. Dunne membranen vormen de barrière tussen lagen. Inleidende testen met inrichtingen vervaardigd in polymethylmethacrylaat (PMMA) en polycarbonaat (PC) dunne films DEP respons van MOSE-L cellen aangetoond. Huidige inspanningen worden gedaan om multi-layer high-throughput apparaten verfijnen en het perifere systeem in de richting van een eventuele plug-and-play-platform te verbeteren. Uitbreiden van de basis experimentele techniek voorgesteld, kunnen de toepassingen en specificaties van de inrichting worden afgestemd op specifieke eisen, zoals sorteren versus karakterisering, of het toevoegen monsterreservoirs en een semi-automatisch systeem om het apparaat te passen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk ondersteund, is mede ondersteund door de National Science Foundation onder Grant No EFRI 0938047, en door de Virginia Tech Institute for Critical Technology en Applied Science (ICTAS). De auteurs willen graag waardering voor Dr Eva Schmelz en Dr Paul Roberts uiten voor hun vriendelijke gift van MOSE-L-cellen. De auteurs erkennen Angela Anderson voor haar hulp bij celkweek, Caitlan Swaffar voor haar hulp met dit document bewerken en het voorbereiden van experimenten, en al Bioelectromechanical Systems lab leden.

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning, Midland, MI,USA	Sylgard 184
Glass slides	The Microscope Depot	76079	2×3 inch-ground edges
Microbore PTFE Tubing	Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA	EW-06417-31	Thin walled 20 gauge, 0.032″ID x 0.056″OD, 100 ft/roll
Luer-slip plastic syringes	National Scientific company	S7510-1
Needle tip	Howard Electronic instruments	JG20-1.0	20 Gauge 1.0″, ID=0.025″ OD=0.036″
D(+)-Sucrose	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S3-500
D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous	Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ	AC410955000
RPMI-1640 Medium	Quality Biological Inc.	112-025-101
Calcein AM, Molecular Probes	Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA	C3100MP	excitation wavelength 488/emission wavelength 516
Rhodamine B, O	Science Lab	SLR1465-100G	excitation wavelength 540/emission wavelength 625
Phosphate buffered saline (10X)	Gbiosciences, St. Louis, MO	RC-147
Leica, inverted light microscope	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	Leica DMI 6000B
Leica DFC420, color camera	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	Leica DFC420
Function generator	GW Instek, Taipei, Taiwan	GFG-3015
Wideband power amplifier	Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA	AL-50HF-A
HFHV Output Transformer		AL-T50-V25/300-F100K-600K
High voltage amplifier	Trek	Model 2205
USB Modular Oscilloscope, 100 MHz	AgilentTechnologies	U2701A
Expanded Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-001/002 (115/230V)	air plasma
Scotch Magic tape	3M		any available width is sufficient
1.5 mm puncher	Harris Uni-Core	Z708836-25EA
.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
FluoSpheres Sulfate Microspheres	Invitrogen	F8858	4.0 μm, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)
AZ 9260 photoresist	AZ Electronic Materials
AZ 400 K developer	AZ Electronic Materials
Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%			provided by Virginia Tech cleanroom
Teflon coating			applied using DRIE machine
Silicon wafer	University Wafer	452	100 mm diameter, 500 μm thickness, one side polished (SSP)
Deep Reactive Ion Etching (DRIE)	Alcatrel	AMS SDE 100

References

Butler, M. . Cell culture and upstream processing. , (2007).
Pratt, E. D., Huang, C., Hawkins, B. G., Gleghorn, J. P., Kirby, B. J. Rare Cell Capture in Microfluidic Devices. Chemical Engineering Science. 66, 1508-1522 (2011).
Salmanzadeh, A. D., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science and Technology. 3, e112 (2013).
Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. The Review of Scientific Instruments. 43, 404-409 (1972).
Adams, J. D., Kim, U., Soh, H. T. Multitarget magnetic activated cell sorter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18165-18170 (2008).
Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3191-3196 (2008).
Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18892-18897 (2007).
Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9, 3038-3046 (2009).
Grover, S. C., Skirtach, A. G., Gauthier, R. C., Grover, C. P. Automated single-cell sorting system based on optical trapping. J. Biomed. Opt. 6, 14-22 (2001).
Lin, S. C. S., Mao, X. L., Huang, T. J. Surface acoustic wave (SAW) acoustophoresis: now and beyond. Lab Chip. 12, 2766-2770 (2012).
Pethig, R. Review Article-Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, (2010).
Gascoyne, P. R. C., Wang, X. B., Huang, Y., Becker, F. F. Dielectrophoretic separation of cancer cells from blood. Ieee T. Ind. Appl. 33, 670-678 (1997).
Pohl, H. A. . Dielectrophoresis : the behavior of neutral matter in nonuniform electric fields. , (1978).
Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science. , (2012).
Markx, G. H., Talary, M. S., Pethig, R. Separation of Viable and Nonviable Yeast Using Dielectrophoresis. J. Biotechnol. 32 (94), 29-37 (1994).
Flanagan, L. A., et al. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 26, 656-665 (2008).
Labeed, F. H., Coley, H. M., Thomas, H., Hughes, M. P. Assessment of multidrug resistance reversal using dielectrophoresis and flow cytometry. Biophys. J. 85, 2028-2034 (2003).
Hoettges, K. F., et al. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Anal. Chem. 80, 2063-2068 (2008).
Lapizco-Encinas, B. H., Simmons, B. A., Cummings, E. B., Fintschenko, Y. Insulator-based dielectrophoresis for the selective concentration and separation of live bacteria in water. Electrophoresis. 25, 1695-1704 (2004).
Davalos, R. V., et al. Performance impact of dynamic surface coatings on polymeric insulator-based dielectrophoretic particle separators. Anal. Bioanal. Chem. 390, 847-855 (2008).
Gallo-Villanueva, R. C., Rodriguez-Lopez, C. E., Diaz-De-La-Garza, R. I., Reyes-Betanzo, C., Lapizco-Encinas, B. H. DNA manipulation by means of insulator-based dielectrophoresis employing direct current electric fields. Electrophoresis. 30, 4195-4205 (2009).
Shafiee, H., Caldwell, J. L., Sano, M. B., Davalos, R. V. Contactless dielectrophoresis: a new technique for cell manipulation. Biomed Microdevices. 11, 997-1006 (2009).
Park, K., Suk, H. J., Akin, D., Bashir, R. Dielectrophoresis-based cell manipulation using electrodes on a reusable printed circuit board. Lab Chip. 9, 2224-2229 (2009).
Jen, C. P., Maslov, N. A., Shih, H. Y., Lee, Y. C., Hsiao, F. B. Particle focusing in a contactless dielectrophoretic microfluidic chip with insulating structures. Microsyst Technol. 18, 1879-1886 (2012).
Hughes, M. P. AC electrokinetics: applications for nanotechnology. Nanotechnology. 11, 124-132 (2000).
Pethig, R. Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, 022811 (2010).
Pethig, R., Ferrari, M. a. u. r. o., Ozkan, M. i. h. r. i. m. a. h., Heller, M. i. c. h. a. e. l. . J. .. Ch. 4. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. 4, 103-126 (2007).
Shafiee, H., Sano, M. B., Henslee, E. A., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Selective isolation of live/dead cells using contactless dielectrophoresis (cDEP). Lab Chip. 10, 438-445 (2010).
Salmanzadeh, A., et al. Dielectrophoretic differentiation of mouse ovarian surface epithelial cells, macrophages, and fibroblasts using contactless dielectrophoresis. Biomicrofluidics. 6, (2012).
Salmanzadeh, A., et al. Isolation of prostate tumor initiating cells (TICs) through their dielectrophoretic signature. Lab Chip. 12, 182-189 (2012).
Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M., Davalos, R. V. Isolation of Rare Cancer Cells from Blood Cells Using Dielectrophoresis. , (2012).
Sano, M. B., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Modeling and development of a low frequency contactless dielectrophoresis (cDEP) platform to sort cancer cells from dilute whole blood samples. Biosens. Bioelectron. 30, 13-20 (2011).
Salmanzadeh, A., et al. Investigating Dielectric Properties of Different Stages of Syngeneic Murine Ovarian Cancer Cells. Biomicrofluidics. , (2013).
Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M. A., Davalos, R. V. . , 590-593 (2012).
Sano, M. B., Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations. Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).
Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar. J. Vis. Exp. (48), e2545 (2011).
Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).
Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Elvington, E. S., Salmanzadeh, A., Stremler, M. A., Davalos, R. V. Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis. J. Vis. Exp. (79), e50634, doi:10.3791/50634 (2013).

Automatically Generated