Dieser Artikel beschreibt drei Nervensystem Präparate mit Blutegeln: intrazelluläre Aufnahme von Neuronen im ventralen Ganglien, die Kultivierung von Neuronen ventralen Ganglien, und der Aufnahme von einem Patch von innerviert Haut Sinnesfelder abzubilden.
Der Süßwasser Blutegel, Hirudo medicinalis, ist eine vielseitige Modellorganismus, die verwendet wurde, um wissenschaftliche Fragen in den Bereichen der Neurophysiologie, neuroethology und Entwicklungsbiologie befassen. Das Ziel dieses Berichtes ist es, experimentelle Techniken aus dem Blutegel-System in einem einzigen Artikel die von Nutzen für Physiologen mit Know-how in das Zentrale Nervensystem Zubereitungen oder Biologie-Studenten mit wenig oder keiner Erfahrung sein Elektrophysiologie wird sich konsolidieren. Wir zeigen, wie man die Blutegel für die Aufnahme von intrazellulär identifiziert neuronalen Schaltkreise im Ganglion sezieren. Weiter zeigen wir, wie einzelne Zellen von bekannten Funktion kann von der Ganglien in einer Petrischale kultiviert werden, und wie man von diesen Neuronen in Kultur aufzeichnen entfernt werden. Dann zeigen wir, wie man einen Patch von innerviert Haut zur Abbildung sensorische oder motorische Felder verwendet werden vorzubereiten. Diese Blutegel Vorbereitungen sind immer noch weit verbreitet, um die grundlegenden elektrischen Eigenschaften der neuronalen Vernetzung Adresseks, Verhalten, Synaptogenese und Entwicklung. Sie sind auch eine entsprechende Ausbildungsmodul für Neurophysiologie oder Lehrlabors.
Der Blutegel Zubereitung nützlich für die Untersuchung der Funktion von identifizierbaren (sensorischen, motorischen und Interneuronen innerhalb des Tieres zentralen Nervensystems (ZNS). Das nützliche Eigenschaft Blutegel Neuronen ist, dass die Form ihrer Aktionspotentiale und biophysikalischen Eigenschaften charakteristisch für a sind gegebenen Zelltyp (dh P, N, T, Rz). Außerdem Neuronen aus dem Tier und kultiviert in einem geeigneten Medium, in dem die Zellen behalten ihre elektrischen Eigenschaften so lange wie 45 Tage 1,2 entfernt werden.
Ein deutlicher Vorteil des Blutegels Ganglion zum Erlernen elektrophysiologischen Ableitungen machen, ist, dass die Zellen charakteristisch und zuverlässig im Ganglion in einem Muster angeordnet, das ermöglicht Identifizierung von unterschiedlichen Zelltypen aus Ganglion Ganglion und von Tier zu Tier. Die einzigartige Lage und die Morphologie von Neuronen im Blutegel Ganglien wurden von Retzius so früh wie 1891 3 notiert haben. Kenntnisse über the Identität und Funktion eines Neurons für die Untersuchung neuronaler Schaltkreise und für die Herstellung von Versuchen mit einem bestimmten Zelltyp vorteilhaft. Aufgrund der relativ großen Zellkörper der Neuronen innerhalb einer Ganglien sie mit einem Binokular sichtbar sind, und die Zellkörper selektiv mit Mikroelektroden zur Aufzeichnung ihrer elektrischen Eigenschaften aufgespießt werden.
Farbstoffe und große Moleküle in einzelne Zellen und Kanaleigenschaften studierte von Patch-Clamp-injiziert werden. Ionenströme, die Anlass zu den verschiedenen Formen der charakteristischen Aktionspotentiale in den verschiedenen Neuronen identifiziert worden 4-7. Aus Untersuchungen in dem Muster der Innervation und Verzweigungen von individuellen Neuronen im ZNS sind die synaptischen Verbindungen in der Kultur mit 2,8 Neuronen identifiziert reproduziert. Studien in den Ganglien Blutegel haben Einblick in die Entwicklung von Funktionskreise, die mit der Elektrophysiologie als auch mit Gr gemessen werden können, zur Verfügung gestelltE tierischen Verhaltensforschung. Der Blutegel CNS hat auch als wertvolle Vorbereitung für die Untersuchung von Mechanismen der neuronalen Reparatur und Regeneration in der gesamten Tier-und in der Kultur 4-6,9-12 beteiligt serviert.
In Säugetier Gehirn es ist eine gewaltige Aufgabe, das Verhalten in Bezug auf die Eigenschaften und Verbindungen einzelner Neuronen identifiziert erklären. Im Prinzip kann man hoffen, dass die Studie von weniger komplexen Systemen wie der Blutegel könnte helfen, grundlegende Mechanismen bei höheren Tieren verwendet definieren. Die Verbindungen, die verwendet werden, die ein Bad-Muster 13,14 und Rhythmik des Herzens 15 zugrunde liegen, wurden auch in der Blutegel aus. Die Fähigkeit einiger Blutegel Neuronen sowohl elektrische und chemische Kommunikation bilden, ist verblüffend. Einige Verbindungen sind bidirektional, während andere unidirektionale chemisch, sondern bidirektionale elektrisch 7. Das Verständnis der synaptischen Verbindungen im Tier sowie Neuerstellung der gleichen type von Verbindungen in einer Kulturschale sind leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung Synaptogenese 16-18 sowie pharmakologischer Profilierung der Synapsen 19. Die hier beschriebenen intrazellulären Aufnahme-und Stimulationstechniken bieten eine Grundlage für pharmakologische Tests und Forschung in neuroethology und Entwicklung.
Darüber hinaus kann die Segmentbauchmark mit einem Patch von innervierten Haut seziert werden. Mit der Fähigkeit, einen Patch von Haut und die Nervenzellen am Leben zu halten, können sensorische rezeptiven Felder durch Aufzeichnung elektrischer Signale aus dem Zellkörper (dh Soma) von sensorischen Neuronen innerhalb der jeweiligen Abdominalganglion im ZNS untersucht werden. Dadurch kann man die Empfindlichkeit der sensorischen Endungen indem unterschiedliche Grade der Kraft auf die Haut beurteilen und Karte rezeptiven Felder: leichte Berührung, Druck, und schädliche (schmerzhafte) Reize 20,21.
Ein Vorteil dieser Blutegel Ganglien Vorbereitung der Haut ist, dass man ca.n ziehen anatomisch das rezeptive Feld Karte und Spuren die neuronalen Prozesse, die der identifizierten Neuron, sobald die elektrischen Antworten aufgezeichnet werden. Die im Folgenden beschriebenen drei Blutegel Experimente können alle mehrfach mit einem einzigen Exemplar, das diese eine kostengünstige Lehrmodul für wissenschaftliche Laboratorien macht abgeschlossen sein.
Der Zweck dieser Versuchsreihe betrug 1) von identifizierbaren Neuronen lehren und zeigen die Grundprinzipien der intrazellulären Aufzeichnungen und 2), um die charakteristischen Formen der elektrischen Signale, die von diesen bestimmten neuronalen Typen mit adulten Blutegel entstehen erkennen. Es gibt eine reiche Geschichte von Untersuchungen mit Hilfe der Blutegel für die neurophysiologische Untersuchungen und Forschung ist im Gange in ein auf Fragen der neuronalen Schaltkreise und Gen-Regulation während der Entwicklung als auch bei der synaptischen Reparatur und Regeneration 10. Neuromodulation, insbesondere durch biogene Amin Wege, hat auch in der Blutegel eine erfolgreiche Forschungsrichtung. Durch die Zugabe von Dopamin und anderen pharmakologischen Mitteln des Nervensystems durch die Kochsalzlösung, hat sich gezeigt, dass Dopamin moduliert neuronale Netzwerke in Entscheidungs 23 und Bewegungsmuster für das Crawlen 24,25 Verhalten beteiligt. Dieser experimentelle Ansatz ist ein einfle (und kostengünstige) Weg, um Modulation in die Lehre zu integrieren Labor und Einstellen der ionischen Zusammensetzung der Salzlösung ist ein effektiver Weg, um die Nernst und Goldman-Hodgkin-Katz-Gleichungen zu lehren.
Um erfolgreich mit den Ganglien Vorbereitungen sein, ist es wichtig, dass vor dem Versuch, eine Soma mit einem intrazellulären Elektrode stecken das Ganglion straff. Ansonsten wird das Soma zu bewegen, wenn Drücken des Glia-Paket. Darüber hinaus, wenn das Ganglion desheathing zum Entfernen von Neuronen für Kultur, vermeiden Sie die Region von Interesse, wenn quer durch das Ganglion so Somen nicht beschädigt werden, da sie entfernt werden. Auch kann eine übermäßige Inkubation der Enzyme in die Neuronen als zu zerbrechlich zu entfernen führen. Es erfordert einige Versuch und Irrtum, um eine ideale Inkubationszeit zu erreichen, weil jede Reihe von Enzymen ist in ihren Handlungen etwas anders.
Weitere Untersuchungen zu Kulturmedien zu optimieren könnte diese Technik zu verbessern. Varischiedenen Faktoren, wie die Anwesenheit von Insulin, Zucker oder Wachstumsfaktoren könnte für längere Aufrechterhaltung der Kulturen untersucht werden. Um festzustellen, wenn die Zellen ihre Fähigkeit, Sender, wie zB Serotonin-Synthese in Rz Zellen synthetisieren zu halten, können neutral-Rot-Färbung angewendet werden, um serotonerge Prozesse kennzeichnen. Auch Mikroglia-Invasion, um verletzte und regenerierende Gewebe kann durch Kern Flecken Tage nach einer Verletzung quantifiziert werden.
Obwohl dieser Zubereitung hat viele Vorteile für die bei der Prüfung der Regeneration und Reparatur sowie neuronalen Schaltkreise zu bieten, die pharmakologische und molekulare Identifizierung der verschiedenen Rezeptor-Subtypen an Synapsen wurden nicht vollständig charakterisiert. Ein exprimierten Sequenz-Tag-Bibliothek ist 26 und der medizinische Blutegel Genom wird derzeit montiert 27, aber die Hauptbegrenzung im Blutegel-Modell im Vergleich zu einigen Präparaten ist die Fähigkeit, das Genom zur selektiven Genen in bestimmten Zelltypen zu ändern. In Embryonen tseine Einschränkung wurde durch die Injektion von DNA oder dsRNA, die Genexpression regulieren 28 angesprochen. Die Gen-Kanone Technik wurde kürzlich verwendet, um wirbellosen Connexin (innexin)-Proteine in Nervenzellen Blutegel auszudrücken. Die Expression eines innexin aus Hirudo verbana (HVE-inx6) ist ausreichend für die Bildung einer Eileiter gap junctions in der medizinischen Blutegel 29. Die Blutegel-oder H. Eisenkraut, wie es ist, 30 waren sicher, unser Verständnis der Physiologie und Entwicklung von elektrischen Synapsen in den nächsten Jahren voranzutreiben.
The authors have nothing to disclose.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
CULTURING MATERIALS | |||
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
04-001 | |||
D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | any company | ||
Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | any company | ||
Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |