Estabelecimento de um<em> In vitro</em> Sistema para estudar o comportamento intracelular de<em> Candida glabrata</em> Em humanos THP-1 macrófagos
Summary
O presente artigo descreve um protocolo para estabelecer um sistema modelo de cultura de células in vitro para estudar a interação de um patógeno humano intracelular facultativo de fungos Candida glabrata com macrófagos humanos, que será uma ferramenta útil para aumentar o nosso conhecimento dos mecanismos de virulência de fungos.
Abstract
Um sistema de modelo de cultura de células, se um mímico de perto as condições ambientais do hospedeiro, pode servir como uma alternativa barata, reprodutível e facilmente manipulável para sistemas de modelo animal para o estudo de um passo específico de uma infecção patogénica microbiana. Uma linha celular monocítica humana THP-1, o qual, após tratamento do éster de forbol, subdivide-se em macrófagos, anteriormente tem sido utilizado para estudar as estratégias de virulência de vários agentes patogénicos intracelulares, incluindo o Mycobacterium tuberculosis. Aqui, discutimos um protocolo para adoptar um modelo in vitro de cultura de células sistema usando THP-1 macrófagos para delinear a interação de um oportunista levedura Candida glabrata patógeno humano com células fagocíticas host. Este sistema modelo é simples, rápido, passíveis de telas de mutantes de alto rendimento, e não requer equipamentos sofisticados. A THP-1 experiência típica a infecção dos macrófagos leva aproximadamente 24 horas, com um adicional de 24-48 horas para permitir intracelular recuperadolevedura de crescer em meio rico para formadoras de colônia análise de viabilidade com base em unidade. Como outros sistemas in vitro do modelo, uma possível limitação dessa abordagem é a dificuldade em extrapolar os resultados obtidos para um circuito de célula imunológica altamente complexo existente no hospedeiro humano. No entanto, apesar disso, o protocolo atual é muito útil para elucidar as estratégias que um fungo pode empregar para evitar / neutralizar resposta antimicrobiana e sobreviver, adaptar e proliferar no ambiente pobre em nutrientes das células do sistema imunológico do hospedeiro.
Introduction
Espécies de Candida são a principal causa de infecções fúngicas invasivas risco de vida em pacientes imunocomprometidos 1. Candida glabrata, um patógeno nosocomial emergente, é o segundo ou terceiro mais frequentemente isoladas espécies de Candida de pacientes unidade de terapia intensiva, dependendo da localização geográfica 1-3. Filogeneticamente, C. glabrata, uma levedura de brotamento haplóides, é mais estreitamente relacionado com os Saccharomyces não modelo levedura patogênica cerevisiae do que patogênica Candida spp. incluindo C. albicans 4. Coerente com isso, C. glabrata carece de algumas características de virulência de fungos-chave, incluindo o acasalamento, a actividade proteolítica secretada e plasticidade morfológica 4-5.
Embora C. O glabrata não formam hifas, pode sobreviver e replicar-se em macrófagos de ratinho e humanos 6-8 sugerindo que desenvolveu mecanismos de patogénese únicas. Não existe informação suficiente sobre as estratégias que C. glabrata emprega para sobreviver ambiente intracelular de macrófagos pobres em nutrientes e neutralizar respostas do hospedeiro não oxidativos montados por células do sistema imunológico do hospedeiro 5 oxidativo e. Um sistema modelo de macrófagos pertinente é um pré-requisito para delinear a interação de C. glabrata com células fagocíticas do hospedeiro através de abordagens de genômica e proteômica funcional. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e os macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) de origem humana e de murino, respectivamente, têm sido anteriormente utilizados para estudar a interacção de C. glabrata com células do sistema imunológico do hospedeiro 7,9. No entanto, a dificuldade na obtenção de PBMC e BMDMs, a sua duração de vida limitada e variação intrínseca entre diferentes doadores de mamíferos restringir a utilização destas células como sistemas modelo versáteis.
Aqui, descrevemos um método para o estabelecimento de um sistema in vitro para estudar a intracellulcomportamento de ar C. células glabrata em macrófagos derivados da linha celular monocítica humana THP-1. O objetivo geral deste protocolo foi a promulgar um sistema modelo de cultura de células simples, barato, rápido e reprodutível, que pode ser facilmente manipulado para estudar diferentes aspectos da interação patógeno-hospedeiro.
Células THP-1 foram anteriormente usadas para decifrar a resposta imune do hospedeiro contra uma vasta gama de agentes patogénicos, incluindo as bactérias, vírus e fungos 10-12. Monocíticas THP-1, as células são fáceis de manter e podem ser diferenciados, após tratamento do éster de forbol, para os macrófagos, que imitam os macrófagos derivados de monócitos de ser humano e expressam marcadores de macrófagos adequados 13. As principais vantagens do THP-1, do sistema modelo de macrófagos são a facilidade de utilização e a falta de equipamento sofisticado requisito.
O protocolo aqui apresentado é facilmente adaptável para estudar a interação de outros fungos patógenos humanos com hosAs células T do sistema imunológico. O processo actual pode também ser empregue para identificar os factores de virulência para o agente patogénico de interesse, utilizando telas de mutantes de elevada capacidade. Esta prova de conceito foi exemplificado pelo uso bem sucedido de THP-1 sistema de modelo de cultura para identificar um conjunto de 56 genes que são necessários para a sobrevivência de C. glabrata em macrófagos humanos 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sistema imune inata desempenha um papel importante no controle de infecções causadas por fungos oportunistas. Os macrófagos contribuem para antifúngicos defesa por ingestão e destruição do patógeno. Assim, a elucidação de fatores que são necessários para a sobrevivência e / ou neutralizar as funções antimicrobianas de macrófagos permitirão uma melhor compreensão das estratégias de virulência de fungos. Neste contexto, nós estabelecemos um sistema in vitro de modelo de cultura celular, utili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Inovador Jovem Biotechnologist Award BT/BI/12/040/2005 e concessão BT/PR13289/BRB/10/745/2009 do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia e os fundos centrais do Centro de Impressões Digitais de DNA e Diagnóstico, Hyderabad. MNR e GB são os destinatários de júnior e sênior de pesquisa Bolsas de Estudo do Conselho de Pesquisa Científica e Industrial para a busca de um doutorado da Universidade Manipal. SB é o destinatário de Júnior e Sociedade do Departamento de Biotecnologia de Pesquisa Sênior para a busca de um doutorado da Universidade Manipal.
Materials
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
References
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study. J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).
- Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. Overview of opportunistic fungal infections in India. Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).
- Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host. Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).
- Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance. FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).
- Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).
- Seider, K., Brunke, S., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).
- Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction. PLoS Pathog. 8 (8), e1002863 (2012).
- Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis. Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).
- Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates. Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).
- Murayama, T., Ohara, Y., et al. Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene. J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).
- Gross, O., Poeck, H., et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence. Nature. 459, 433-436 (2009).
- Auwerx, J. The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).
- Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester. Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).
- Castaño, I., Kaur, R., et al. Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata. Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).
