Istituzione di un<em> In vitro</em> Sistema per studiare intracellulare Comportamento<em> Candida glabrata</em> In umani THP-1 macrofagi
Summary
L'attuale articolo descrive un protocollo per stabilire un sistema cellulare modello di coltura in vitro per studiare l'interazione di una facoltativo intracellulare patogeno fungino umano Candida glabrata con i macrofagi umani che saranno un utile strumento per far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi di virulenza fungine.
Abstract
Un sistema cellulare modello di coltura, se un vicino mimo di condizioni ambientali ospitanti, può servire come un'alternativa economica, riproducibile e facilmente manipolabile per sistemi modello animale per lo studio di una fase specifica di infezione microbica patogeno. Una linea cellulare monocitica umana THP-1 che, al momento phorbol trattamento estere, è differenziato in macrofagi, è già stata utilizzata per studiare le strategie di virulenza di molti patogeni intracellulari, tra cui Mycobacterium tuberculosis. Qui, discutiamo un protocollo di emanare una cellula in vitro modello di cultura sistema che utilizza THP-1 macrofagi per delineare l'interazione di un opportunista lievito Candida glabrata agente patogeno umano con fagociti host. Questo sistema modello è semplice, veloce, suscettibili di schermi mutanti high-throughput, e non richiede attrezzature sofisticate. Un tipico esperimento THP-1 infezione dei macrofagi richiede circa 24 ore con un ulteriore 24-48 ore per permettere intracellulare recuperatolievito di crescere su terreno ricco di formanti colonia analisi fattibilità basato su unità. Come altri sistemi modello in vitro, un possibile limite di questo approccio è la difficoltà di estrapolare i risultati ottenuti da una circuiteria cellule immunitarie altamente complesso esistente nell'ospite umano. Tuttavia, nonostante questo, l'attuale protocollo è molto utile per chiarire le strategie che un patogeno fungino può utilizzare per eludere / contrastare risposta antimicrobica e sopravvivere, adattarsi e proliferare in un ambiente povero di nutrienti delle cellule immunitarie dell'ospite.
Introduction
Specie di Candida sono la principale causa di infezioni fungine invasive potenzialmente letali nei pazienti immunocompromessi 1. Candida glabrata, un patogeno nosocomiale emergente, è il secondo o il terzo più frequentemente isolati specie di Candida da pazienti nell'unità di terapia intensiva a seconda della posizione geografica 1-3. Filogeneticamente, C. glabrata, un lievito in erba aploidi, è più strettamente legato alle Saccharomyces non lievito modello patogeno cerevisiae che a patogeni Candida spp. tra cui C. albicans 4. Coerentemente con questo, C. glabrata manca di alcune caratteristiche di virulenza fungine chiave, tra cui l'accoppiamento, attività proteolitica secreto e la plasticità morfologica 4-5.
Sebbene C. glabrata non forma ife, può sopravvivere e riprodursi nei macrofagi murini ed umani 6-8 suggerendo che essa ha sviluppato meccanismi di patogenesi unici. Sono disponibili informazioni limitate circa le strategie che C. glabrata impiega per sopravvivere nell'ambiente intracellulare dei macrofagi poveri di nutrienti e contrastare ossidativo e risposte dell'ospite nonoxidative montati da ospite cellule immunitarie 5. Un pertinente modello di sistema dei macrofagi è un prerequisito per delineare l'interazione di C. glabrata con fagociti host tramite approcci di genomica e proteomica funzionale. Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e macrofagi derivate dal midollo osseo (BMDMs) di origine umana e murina, rispettivamente, sono prima stati utilizzati per studiare l'interazione di C. glabrata con ospite cellule immunitarie 7,9. Tuttavia, la difficoltà nell'ottenere PBMC e BMDMs, la loro durata di vita limitata e la variazione intrinseca tra i diversi donatori mammiferi limitano l'utilizzo di queste cellule sistemi modello come versatili.
Qui, descriviamo un metodo per la creazione di un sistema in vitro per studiare la intracellulcomportamento ar di C. cellule glabrata in macrofagi derivati dalla linea cellulare monocitica umana THP-1. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di stabilire un modello di sistema di coltura cellulare semplice, poco costoso, veloce e riproducibile che può essere facilmente manipolato per studiare diversi aspetti di interazione ospite-patogeno fungino.
Cellule THP-1 sono stati precedentemente utilizzati per decifrare la risposta immunitaria contro una vasta gamma di agenti patogeni quali batteri, virus e funghi 10-12. Monocitaria THP-1 le cellule sono di facile manutenzione e possono essere differenziati, previo trattamento esteri phorbol, ai macrofagi che imitano i macrofagi derivate da monociti di risorse umane ed esprimono adeguatamente i marcatori macrofagi 13. I principali vantaggi di THP-1 sistema modello macrofagi sono la facilità d'uso e la mancanza di sofisticate apparecchiature requisito.
Il protocollo qui presentato è facilmente adattabile a studiare l'interazione di altri patogeni fungini umani con host cellule immunitarie. L'attuale procedura può anche essere impiegato per identificare i fattori di virulenza per l'agente patogeno di interesse utilizzando schermi mutanti alto rendimento. Questa prova di concetto è stato esemplificato dal successo nell'uso di THP-1 sistema modello di coltura per identificare un insieme di 56 geni che sono necessari per la sopravvivenza di C. glabrata in macrofagi umani 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sistema immune innato svolge un ruolo importante nel controllo delle infezioni fungine opportunistiche. I macrofagi contribuiscono alla difesa antimicotici per ingestione e la distruzione del patogeno fungino. Così, delucidazione di fattori che sono necessari per la sopravvivenza e / o contrastare le funzioni antimicrobiche di macrofagi avanzerà la nostra comprensione delle strategie di virulenza fungine. In questo contesto, abbiamo stabilito un sistema cellulare modello vitro in coltura utilizzando macrofagi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da Innovative Giovane Biotechnologist Award BT/BI/12/040/2005 e BT/PR13289/BRB/10/745/2009 concessione dal Dipartimento di Biotecnologie, Governo dell'India e dei fondi fondamentali del Centro per l'impronta digitale del DNA e diagnostica, Hyderabad. MNR e GB sono i destinatari di Junior e Senior Research Fellowships del Consiglio di ricerca scientifica e industriale verso il perseguimento di un dottorato di ricerca dell'Università Manipal. SB è il destinatario di Junior e Senior Research Fellowship del Dipartimento di Biotecnologie verso il perseguimento di un dottorato di ricerca dell'Università Manipal.
Materials
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
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