Moteur section du nerf et imagerie time-lapse de comportements de cellules gliales chez le poisson zèbre en direct

Le poisson zèbre ont été largement utilisées pour étudier le développement du système nerveux en raison de leur transparence optique et la facilité de la transgénèse, qui, lorsqu'il est couplé, pour permettre l'imagerie spectaculaire des comportements cellulaires dynamiques dans un embryon vivant. En outre, parce que le poisson-zèbre et les mammifères partagent presque tous les gènes nécessaires à la formation du système nerveux, l'information cellulaire et moléculaire collectées dans cet organisme modèle est directement rattachables à d'autres espèces de vertébrés. Même si incroyablement puissant pour les études du développement neural, le poisson zèbre et ses attributs uniques ont le potentiel pour élucider aussi les mécanismes qui maintiennent et reconstruire le système nerveux après une blessure. Les larves de poisson zèbre maintenir leur translucidité dans les stades larvaires fin et la pigmentation peut être effectivement bloqué soit avec l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques de la production de mélanine ou des mutants génétiques qui manquent cellules pigmentaires. Ainsi, en utilisant cet organisme modèle pour étudier les blessures et Regeneration chez les animaux âgés est possible et offre l'opportunité unique d'étudier directement les mécanismes cellulaires et moléculaires qui reconstruire le système nerveux. Dans ce manuscrit, nous décrivons comment blesser de manière efficace et reproductible nerfs dans les PNS de larves de poisson zèbre. Ce paradigme de la blessure elle-même prête à étudier non seulement la dégénérescence, mais aussi les réponses de la glie périphérique et les cellules immunitaires ainsi que les interactions entre ces populations au cours de la régénération.

Le PNS est un réseau complexe de nerfs moteurs et sensoriels qui est nécessaire pour transmettre des informations entre le système nerveux central (SNC) et la peau, les organes et les muscles du corps, permettant un organisme d'interagir avec son environnement et survivre. Le long de ces nerfs, la glie périphérique, y compris les cellules myélinisation et non myélinisants Schwann et gliales perineurial, ainsi que les tissus conjonctifs, enferment les axones et en définitive constituer le nerf mature. Blessure de ces nerfs initie un processus kurnommée Wallerian dégénérescence ^10. Ce mécanisme de fragmentation axonale, le recrutement immunitaire, déblaiement des décombres et la régénération est très stéréotypé et génétiquement réglementé ^1. Des études antérieures chez les mammifères ont décrit les rôles des cellules de Schwann au cours de la dégénérescence nerveuse et la régénération ^{1, 2, 6, 8.} Dans ces études de tissu fixe ou culture de cellules, les cellules de Schwann non seulement recrutés macrophages au site de la lésion afin d'aider à déblaiement des décombres, mais aussi aidé à la myéline se phagocytose. Bien que ces études ont été incroyablement instructif, nous n'avons jamais avant réponses gliales visualisés à une lésion axonale périphérique in vivo en temps réel, et pas d'autres études ont examiné la relation entre les différentes classes de la glie périphérique lors de ces événements.

Récemment, plusieurs laboratoires ont étudié la dégénérescence Wallerian utilisant le poisson zèbre et les blessures de l'axone laser à médiation similaire à ce que nous décrivons ici <sup> 4, 5, 7, 9. Dans certaines de ces études, les axones sensoriels superficiels ont été axotomisés chez les jeunes larves en utilisant un custom built, à deux photons microscope confocal ^{4, 5, 9.} Dans une autre étude, qui est très semblable à la nôtre, les axones les plus profondes au sein du nerf moteur ventral ont été recoupées dans des larves âgées de 5 jours en utilisant un système d'ablation laser disponibles dans le commerce ^7. Dans ces deux expériences set-ups, l'accent était mis sur la dégénérescence Wallerian et les axones et les cellules immunitaires ont été imagées. Pour développer ces études, nous décrivons blessant axones moteurs dans les larves plus âgées avec plus matures, les nerfs myélinisés et analyse la réponse de tous les glie nerf périphérique associée au cours de la dégénérescence et de régénération.

Pour ce faire, nous transect nerfs moteurs à 6 et après la fécondation de 7 jours (DPF) de larves et de visualiser les réponses des populations gliales individuelles ainsi que d'enquêter sur les interactions entre ces populations le long des axones blessés. Utilisation double et triple tralignes nsgenic que la glie périphérique de l'étiquette, y compris les cellules de Schwann et gliales perineurial, ainsi que d'un marqueur pour les axones, nous utilisons un système d'ablation laser disponibles dans le commerce consistant en un atome d'azote pompé par laser à colorant (longueur d'onde 435 nm) attaché à un système confocal à disque rotatif pour créer transections axone. Cela permet expérimental de visualiser en direct, le poisson-zèbre larvaire, blesser voies axonales moteurs périphériques spécifiques et l'image time-lapse les réponses des populations gliales distinctes d'une blessure axonale et leur relation à l'autre. Ce protocole peut être plus adapté pour créer des blessures nerveuses chez le poisson zèbre d'âges différents, avec différentes lignées transgéniques ou des mutants génétiques pour aborder différentes questions scientifiques.