Microinjeção estereotáxica de vetores virais Expressando Cre Recombinase para estudar o papel de genes alvo em cocaína condicionado Lugar de Preferência

A cocaína é um psicoestimulante altamente reforço. Após a exposição repetida, várias adaptações celulares e moleculares ocorrem em circuitos cerebrais de recompensa relevante que são acreditados para resultar em compulsivo de drogas comportamento de busca, fazendo com altas taxas de recaída que representam um sério problema clínico ^1. A cocaína exerce esses efeitos comportamentais de longa duração por regulação da expressão gênica. Para estudar as adaptações que surgem do uso crônico da cocaína, os modelos pré-clínicos de roedores têm sido amplamente utilizados. Um tal modelo é a preferência paradigma local condicionado (CPP). Este modelo envolve o desenvolvimento de uma associação entre um ambiente aprendido anteriormente neutro e as propriedades gratificantes de cocaína. Depois de vários pares de cocaína com uma câmara particular, os animais estão autorizados a explorar livremente os ambientes cocaína pareado e não-pareado cocaína e se eles preferem o compartimento de droga pareado, eles dizem ter adquirido uma plac induzida pela cocaínae de preferência. Além disso, na sequência de um período de treino de extinção, este paradigma podem ser usadas para estudar a reintegração específica do contexto do comportamento de procura de cocaína.

Em comparação com outros modelos comportamentais de comportamento aditivo semelhante, tais como a sensibilização psicomotora, que é usada para estudar a longo prazo induzida por cocaína comportamental e plasticidade molecular ^2,3 e auto-administração (SA), que é pensado para mimetizar mais precisamente viciante -como o comportamento encontrado em seres humanos, o paradigma CPP é um procedimento simples para estudar cocaína aprendizagem contextual ^4. Protocolos CPP pode ser convenientemente estendido para incluir as fases reintegração extinção e, à semelhança do SA, que permitem a investigação dos mecanismos subjacentes a ânsia da droga e recaída ^5-7 e que são acreditados para recapitular aspectos do que ocorre em humanos droga comportamento de busca e drogas – e cue-induced recaída ^8-10.

Um mecanismo que está na base dainduzida por cocaína plasticidade comportamental, que é característica de cada uma das fases distintas do CPP, incluindo a aquisição, extinção, e reposição, é a activação de assinaturas únicas de expressão do gene em diferentes regiões do cérebro. Para testar quais genes directamente dentro das regiões do cérebro relevantes para mediar a recompensa cocaína induziu alterações comportamentais, é útil ser capaz de manipular selectivamente de forma regional específica. Uma maneira de conseguir isso é microinject vetores virais recombinantes adenoassociados (rAAV) que expressam Cre recombinase usando cirurgia estereotáxica, em áreas distintas do cérebro de ratos que têm genes alvo ladeado por sites LoxP (ratos floxed). Este método permite um controlo temporal e regionais muito preciso sobre quando e onde os genes são ablação, em ambos os neurónios que dividem e que não se dividem, sem induzir respostas imunes ^11-13. Este nível de controle representa uma vantagem importante sobre a tecnologia tradicional Cre-LoxP de reprodução camundongos floxed with ratinhos que expressam a recombinase Cre sob o controle de um promotor de gene endógeno, em que a temporização e distribuição de deleção do gene pode ser mais fortemente regulado. Além disso, o vetor viral mediada por nocaute gene evita potenciais efeitos de compensação de desenvolvimento que podem ocorrer usando estratégias knockout tradicionais.

Em adição à cocaína CPP, que é aqui descrito, a microinjecção de rAAV-Cre no cérebro de ratinhos floxed para avaliar o papel de genes específicos pode ser aplicado para ubiquamente paradigmas comportamentais que envolvem fases distintas, incluindo a auto-administração e sensibilização psicomotora. Por exemplo, o nosso laboratório tem utilizado a tecnologia de rAAV-Cre para estudar o papel do Ca _{V 1.2} canais de Ca ^{2 +} do tipo-L de cocaína psicomotora sensibilização ^14. Especificamente, rAAV-Cre foi microinjectado no núcleo accumbens (NAC) de ratinhos com o gene que codifica a Ca _v 1.2 floxed, para demonstrar que o Ca _v </sub> 1.2 atuando nesta região medeia a fase de sensibilização psicomotora ^14,15 expressão. No entanto, a estratégia de rAAV-Cre não pode ser utilizado se os ratos com um gene de interesse floxed não existem, como foi a nossa experiência quando se avalia o papel de Ca _V 1.3 canais de Ca ^{2 +} do tipo-L de sensibilização psicomotora. Assim, uma limitação da utilização de rAAV-Cre apresenta-se se os ratos condicionados não existem para um determinado gene de interesse. No entanto, rAAVs que expressam siRNA podem ser usadas para genes alvo knockdown, como fizemos para examinar o papel do CA _V 1.3 canais ^14,15.

Microinjecting rAAV-Cre em regiões cerebrais distintas de camundongos floxed e, em seguida, testá-las no paradigma do CPP permite a investigação sobre os genes específicos que medeiam as várias fases do comportamento viciante-como e onde eles estão atuando. O uso deste paradigma tem ajudado na nossa compreensão de como a administração repetida de cocaína em essência seqüestra o brains circuito de recompensa causando alterações inadequadas em vias de transdução de sinal molecular e expressão de genes que levam ao estado viciado ^1,16,17.