Использование изображения Цитометрии для количественного определения патогенных грибов в связи с клетки-хозяева
Summary
Здесь показано, как изображение цитометрии может использоваться для количественного определения патогенных грибов в связи с хост клеток в культуре. Этот метод может быть использован в качестве альтернативы перечисление КОЕ.
Abstract
Исследования клеточных механизмов патогенеза патогенные дрожжи, такие как Candida Albicans, Histoplasma capsulatum и Cryptococcus neoformans обычно используют заражение хозяев-млекопитающих или клетки-хозяева (т.е. макрофаги) с последующим использованием дрожжей количественного анализа колониеобразующих единицы или проточной цитометрии. В то время как колониеобразующие единицы перечисление была наиболее широко используемый метод в данной области, этот метод имеет недостатки и ограничения, в том числе медленный рост некоторых видов грибов на твердой среде и низкой и / или переменной эффективности покрытие, которое представляет особый интерес при сравнении роста дикого типа и мутантных штаммов. Проточная цитометрия может обеспечить быстрое количественной информации о дрожжи жизнеспособности, однако, применение проточной цитометрии обнаружения патогенных дрожжей было ограничено по ряду практических причин, включая его высокой стоимости и биологической соображений. Здесь мы демонстрируем на основе образацитометрические методологии с использованием Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience ООО) для количественного определения жизнеспособных патогенных дрожжей в совместной культуре с макрофагами. Наши исследования направлены на выявление двух человеческих патогенных грибов: Histoplasma capsulatum и Candida Albicans H.. capsulatum колонизирует альвеолярных макрофагов путем репликации в макрофагах фагосома, и здесь, мы количественно оценить рост H. capsulatum дрожжей в RAW 264.7 макрофагами использованием акридиноранжа / пропидий йодида окрашивания в сочетании с изображения цитометрии. Наш метод точно повторяет тенденции роста как измеряется традиционными колониеобразующая единица перечисления, но со значительно более высокой чувствительностью. Кроме того, мы непосредственно оценить инфекции живых макрофагов с GFP-экспрессирующих штамм C. Albicans. Наша методика предлагает быстрое, точное и экономичное средство для обнаружения и количественного определения важных человеческих патогенных грибов в остроумии ассоциациич клетки хозяина.
Introduction
Исследования патогенных грибов в связи с их хозяев и / или клетки-хозяева, часто требуют количественного жизнеспособных клеток грибов за время курса или в других условиях инфекции. Перечень колониеобразующих единиц (КОЕ) представляет собой стандартный метод, посредством которого количество жизнеспособных клеток грибов были измерены, однако, этот метод имеет ряд недостатков и ограничений. Во-первых, многие виды грибов растут медленно. Рост видимые колонии на твердой среде может занять 1-2 недели, что значительно замедляет темпы научных исследований. Во-вторых, манипуляции образцов в процессе покрытия КОЕ это трудоемкий процесс, так как несколько разведения должны быть покрыты для обеспечения счетного числа колоний. В-третьих, количество КОЕ, как правило, ниже, чем количество жизнеспособных организмов покрытием, так как покрытие эффективность значительно ниже 100%. Например, покрытие для эффективности диморфными грибкового патогена Histoplasma capsulatum может быть выше, чем 90%, но обычно по цене от30% и даже ниже (10%) для соответствующих грибковых диморф Paracoccidioides Brasiliensis 1, 2. Покрытие эффективности Candida Albicans также подвержен изменчивости 3. Наконец, анализ КОЕ составляет только живых и активно делящиеся клетки, способные устанавливать роста на твердой среде, в то время как во многих ситуациях, было бы полезно, чтобы определить наличие и концентрацию мертвыми и / или метаболически неактивные клетки.
Ранее методов проточной цитометрии для количественного определения нескольких патогенных видов грибов были описаны 4-6. Однако из-за биобезопасности сдерживания проблемы при использовании уровня биобезопасности 2 (BSL2) или BSL3 уровня патогенов на общих цитометрах потока, принятие эта техника была ограничена. Как проточной цитометрии, изображения цитометрии является чувствительным и быстрый метод клеточной количественной оценке. Тем не менее, изображение цитометрии могут быть выполнены в часть стоимости с аналогичными результатами 7 –11. Здесь мы описываем методы для выполнения изображение цитометрии патогенных грибков в сочетании с клетками-хозяевами. Мы демонстрируем наши методы с использованием двух человеческих патогенных грибов: Histoplasma capsulatum и Candida Albicans H.. capsulatum является диморфными грибкового патогена, вызывающих респираторные заболевания, а в людях, он растет как начинающим дрожжей и повторяет в альвеолярных макрофагах Candida Albicans является человеком синантропных видов, которые иногда вызывает кандидоз.. Мы покажем, что изображения цитометрии позволяет быстрое количественное эти дрожжи, вместе с визуализацией возможности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изображение цитометрии позволяет пользователю захватить высокое качество изображения и, используя специализированное программное обеспечение, выполнить быстрое количественное клеток. Один потенциальный вызов принятием изображения цитометрии в области микробного патогенеза явля?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience |
References
- Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
- Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
- Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
- Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
- Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
- Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
- Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
- Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
- Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
- Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
- Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
- Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).
