Vi beskriver en robust og allsidig protokoll for å analysere kjernefysisk arkitektur ved 3D DNA FISH hjelp direkte merket fluorescerende prober.
3D DNA FISH har blitt et viktig verktøy for å analysere tredimensjonale organiseringen av kjernen, og flere varianter av teknikken har blitt publisert. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll som er optimalisert for robusthet, reproduserbarhet, og brukervennlighet. Lyst fluorescerende direkte merkede prober er generert ved nick-translasjon med amino-allyldUTP etterfulgt av kjemisk kopling av fargestoffet. 3D DNA fisken er utført ved hjelp av en fryse-tine trinnet for celle permeabilization og et oppvarmingstrinn for samtidig denaturering av proben og nukleært DNA. Protokollen er aktuelt for en rekke celletyper og en rekke sonder (BACS, plasmider, fosmids, eller hele kromosomer Maling) og gir mulighet for høy gjennomstrømming automatisert bildebehandling. Med denne metoden rutinemessig vi undersøke kjernefysiske lokalisering av inntil tre kromosomale regioner.
DNA fluorescens in situ hybridisering (FISH-DNA) gir den tredimensjonale visualisering av individuelle genloci, subchromosomal domener og til og med hele kromosomer under alle faser av cellesyklusen. 2D FISH brukes for metafase studier mens 3D fisk har vært mye brukt for å undersøke forholdet mellom den romlige organiseringen av genomet og dens funksjon under interfase (1,2 og referanser deri). Historisk ble co-foreningen studier utført ved å undersøke titalls til hundrevis av individuelle loci ved FISH. Mer nylig kraftig høy gjennomstrømning 3C-baserte teknikker som 4C og Hi-C har blitt utviklet tre, slik at etterforskningen av molekylære krysstale mellom mange tusen forskjellige loci. Mens 3C-baserte teknikker og DNA fisk kan være komplementære metoder, har de ikke nødvendigvis svare på de samme spørsmålene. 3C baserte metoder gir et ensemble avlesning av blandede celle populasjoner, noe som resulterer i en probabiltet for co-foreninger. I kontrast, mens lav i gjennomstrømning, FISH teknikker gir mulighet til å analysere romlige arrangementer av loci eller kromosomer i individuelle celler i henhold til deres utviklings-eller celle syklus etapper. Derfor vil FISH fortsette å være et viktig verktøy for sondering kjernefysiske struktur-funksjon relasjoner.
Det er to viktige hensyn i å utføre vellykkede 3D fisk eksperimenter. Disse er; en. skaffe optimalt merkede prober og to. Valget av mobilnettet behandlinger, inkludert fiksering, pre-og post-hybridisering trinn, for å bevare kjernefysisk morfologi så mye som mulig, samtidig som DNA tilstrekkelig tilgjengelig for sondehybridisering. Effektiv probe merking er kritisk viktig for FISH. Tradisjonelt har nick-oversettelse blitt brukt for å innføre enten hapten eller fluorofor-konjugerte nukleotider 4.. Tilsvarende kommersielle nick-oversettelse Pakkene er tilgjengelig for direkte hapten eller fluorophore innlemmelse, but også for to-trinns merking ved hjelp aminoallyl nukleotider og amin-reaktive fargestoffer. Sistnevnte gjør dye innlemmelse mer effektiv ved å gi DNA polymerase en mindre klumpete molekyl å jobbe med. Mer nylig har sett for ikke-enzymatisk merking av DNA blitt utviklet som utnytter koordinerende binding av platina til nukleinsyrer. FISH prober kan også kjøpes allerede merket fem. Mens kits og kommersielt produsert sonder uten tvil gi brukervennlighet, de er betydelig dyrere enn å kjøpe de enkelte komponentene og produsere sonder i huset. Vi optimalisert en lav kostnad nick-translasjon-protokoll for å direkte merke mange forskjellige BAC prober i flere farger. Vi har oppdaget at å skaffe et høyrent BAC DNA er kritisk og resulterer i et krav om bare 10-20 ng probe pr fisk lysbilde, sammenlignet med 10 – 20 ganger mer når uren mal-DNA blir brukt, noe som resulterer i betydelige kostnads-og arbeidskrevende besparelser. Bruken av amino-allyldUTP tillater merking av fleksibelprober med tilgjengelige amin-reaktive fargestoffer (f.eks Alexa Fluor eller Cy-fargestoffer) eller haptener (f.eks biotin, Digoxigenin). Hapten-merkede prober blir detektert av fluorofor-konjugerte antistoffer eller streptavidin for å forsterke og visualisere signalet. Bright direkte merkede prober viser generelt mindre bakgrunn flekker og unngå over-forsterkning av signaler, dermed resulterer i en mer nøyaktig gjengivelse av kjernefysiske lokalisering og locus morfologi.
Det finnes flere forskjellige FISH teknikker som bruker ulike bindemiddel, pre-behandlinger, og post-hybridisering vasker men disse vanligvis faller inn i følgende kategorier: glutaraldehyd fiksering med NaOH denaturering, formaldehyd fiksering med HCl denaturering, og formaldehyd fiksering med varme denaturering 6-9 . Hver av disse har fordeler og ulemper. Glutaraldehyd fiksering resulterer i god kjernefysisk strukturelle bevaring, men krever behandling med reduksjonsmidler å minimereden resulterende autofluorescence, og NaOH behandling må kontrolleres nøye for å balansere tilstrekkelig DNA denaturering og potensiell skade på kjernefysisk struktur 6. Formaldehyd fiksering er mindre sterk, noe som gir en økt sannsynlighet for forstyrrelsene av kjernefysisk arkitekturen, men også vanligvis gi sterkere og mer pålitelig signaler og lavere autofluorescens 9.. HCl behandling depurinates DNA og strimler ut proteiner, noe som gir god tilgang til DNA for sondene, men kan også innføre DNA pauser. Oppvarming skiller fysisk de to DNA-trådene som resulterer i god target hybridisering og sterke signaler, men kan føre til at noen forstyrrelse av kjernefysiske struktur åtte. Den grad til hvilken hver av disse teknikkene påvirker protein epitoper varierer sterkt 6,9, som resulterer i behovet for å bestemme eksperimentelt for hvert protein optimal protokollen som skal brukes i immuno-Fish eksperimenter.
Mens det ikke er "perfekt" DNA FISH technique, kan de alle være nyttig hvis godt kontrollert. Vårt mål var å optimalisere en protokoll for robust og reproduserbar DNA FISH for å undersøke romlige posisjonering av flere loci i en rekke celletyper 10, med fokus på oppvarming metode for de fleste pålitelige signaler. Med dette og anvendelse av et automatisert avbildningssystem rettet vi på å øke gjennomstrømningen for enkelt-celle analyse av kjernefysiske ordninger.
3D DNA FISH har blitt et anerkjent verktøy for å analysere romlige ordninger i kjernen. Mens FISH gir visuelle og direkte resultater, som med hver teknikk, må man være klar over sine begrensninger. DNA FISH ansikter iboende problem som relativt tøffe behandlinger er nødvendig for å gjøre kromatin tilgjengelig for FISH sonder som til slutt forstyrrer kjernefysisk struktur-svært ting som skal analyseres. Flere strategier har vært gjort for å sjonglere tilgjengelighet og struktur bevaring. I protokollen som er beskrevet her, er kromosomal DNA gjort tilgjengelig med fryse-tine permeabilization av celler og varme denaturering før sondehybridisering. Solovei, et al., (2002) analyserte strukturelle endringer etter lignende behandling, og fant at den gjennomsnittlige forskyvning av kromatin domener var 300 nm som begrenser oppløsningen av strukturell analyse til om lag 1 Mb regioner i genomet åtte. Mens dette ikke er høy oppløsning, deter en rimelig skala for å analysere kjernefysisk stilling.
En mer praktisk hensyn til FISH analyse er at bildeopptak og målinger av kjernefysiske avstandene er tidkrevende prosesser som begrenser antall kjerner som kan analyseres. For å studere sjeldne hendelser vi som mål å gjøre høy gjennomstrømming automatisert bildebehandling. Deretter, med egnede kontroller på plass, kan tilstrekkelig antall sammenlignes for å muliggjøre robust statistisk analyse av romlige relasjoner. Vi rutinemessig analyse 600 kjerner per datapunkt som vi fastslå 3D-koordinatene til alle FISH signaler i kjernefysiske volum. Disse dataene krever svært lite lagringsplass og gir mulighet for analyse av inter-og intra-allelisk avstander, eller radial posisjoner til enhver senere tidspunkt. Videre kan automatisert behandling utføres i en forsker blind måte som i stor grad reduserer sannsynligheten for bevisstløs skjevhet.
For å aktivere denne typen høy gjennomstrømning analyser, var vårt mål å etablere en rask og effektiv måte å utføre DNA FISH. Vi fant protokollen beskrevet her for å være svært robust, konsekvent produsere sterke signaler med lav bakgrunn. Det fungerte for alle celletyper vi prøvde forutsatt at vi tilpasset det skritt å feste cellene til lysbildet. Dessuten, med ett unntak, kunne alle BACS vi brukte bli omgjort til lyse sonder. Vi har også med hell oppdaget en rekke kjernefysiske proteiner ved antistoffarging etter DNA FISH. Mens for noen proteiner dette fungerer godt, anbefaler vi sammenligning med tradisjonelle immunfluorescens (IF) for å sikre konsistens i antistoffarging mønster mellom IF og DNA immuno FISH (sammenlign 11).
Generelt, fant vi at prober merket i forskjellige farger produsert de samme resultatene. Imidlertid bør følgende aspekter tas i betraktning ved valg av merking fargestoff. Først må fargen på fluoroforen å være godt påviselig i mikroskop used. Andre bør bølgelengden til lyset som emitteres av fluoroforene være tilstrekkelig forskjellig for å unngå utfalling gjennom inn i den andre kanal. Dette vil avhenge av filtrene i mikroskop. Og for det tredje, i det minste i våre hender, noen farger produsere lyse signaler med større jevnhet enn andre. Vi har alltid brukt DAPI (blå) som en counterstain som gjør Alexa Fluor 555 (rød), 488 (grønn) og 647 (langt rødt) gode valg for merking sonder. Med vår imaging system, fant vi Alexa Fluor 555 (rød) til å produsere de skarpeste signaler, etterfulgt av Alexa Fluor 488 (grønn). Alexa Fluor 647 (langt rødt) har den ulempen at den ikke kan oppdages av det menneskelige øyet og derfor ingen signaler kan sees når man ser ned i mikroskopet. Dermed, hvis du gjør to-farge FISH, anbefaler vi en kombinasjon av røde og grønne fargestoffer.
To prinsipielle problemer kan oppstå: celler vask av lysbilder og svake signaler. Hvor godt cellene holder seg til raset er enormt variabel between celletyper, og den beste protokollen for å bosette / frø cellene må bestemmes. Vi har med hell brukt enten positivt ladet eller Poly-L-lysin belagt lysbilder (kjøpt klar til bruk), men fant celler generelt levd bedre å Poly-L-lysin belagt lysbilder. Vi fant også at når cellene var for tette hele områder ville skrelle av som et ark, mens automatisert bildebehandling var hemmet hvis cellene var for tynt. Således, dersom prøven ikke er for kostbar, bør ulike celle tall bli utsådd for å bestemme den ideelle tetthet. Hvis cellene er spesielt utsatt for å vaske av, kan en hydrofob barriere penn brukes, og fisk trinn kan utføres ved forsiktig pipettering løsninger direkte på lysbildet. Pipettering også reduserer drastisk volumene av reagenser som trengs, men tar betydelig lengre tid når du gjør flere lysbilder.
Svake signaler er vanligvis på grunn av dårlig sonder, og det er vel verdt å investere tid i å lage gode. Ren BAC DNA bør bruked som utgangsmateriale som kan oppnås ved gjentatt utfelling eller kommersielt tilgjengelige kit. Kontaminering med bakterielt genom DNA påvirker negativt sonde kvalitet og forsiktig håndtering under cellelyse og filtrering av den cellelysat er nødvendig for å holde den på et minimum. Det er imidlertid ikke nødvendig å anvende en eksonuklease trinn å fordøye lineære DNA, da denne i stor grad reduserer utbyttet. Effektiv merking av proben er avgjørende. Den viktigste kvalitetskontroll for dette trinnet er å sjekke fragment størrelse etter nick oversettelse (se Representative resultater). En "god" smøre vil nesten alltid resultere i en fargerike probe. Vi har imidlertid funnet at av og til en viss BAC ikke kan behandles i en god sonden, og en annen BAC må velges. Et annet viktig skritt er varme denaturering. Hvis temperaturen er for lav, vil DNA være bare delvis denaturert og sondehybridisering vil bli svekket. Hvis temperaturen er for høy, kjernekraft struktur will perturbert mer enn nødvendig. I våre hender, er 78 ° C på en varm blokk invertert den ideelle kompromiss, men dette kan variere avhengig av den respektive varme-blokk benyttes.
Vi har hatt gode resultater ved hjelp Vectashield montering medium, men fant ut at SlowFade Gold har mindre bakgrunn og bevarer den fluorescerende signal lenger. Vi anbefaler ikke bruk av hard-set montering medium som vi fant dette å påvirke 3D-struktur og å danne luftbobler over tid.
Som konklusjon, lyst fluorescerende merkede prober direkte sammen med den DNA FISH-protokollen er beskrevet her gir en effektiv løsning for robust og hurtig analyse av kjernefysisk arkitektur som er anvendelig til en lang rekke biologiske spørsmål.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av BBSRC og Wellcome Trust. Vi vil gjerne takke Simon Walker for å få hjelp med bildebehandling og Felix Krueger for hjelp med bioinformatiske analyser.
Reagent/Material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NTB buffer | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DTT | Invitrogen | D-1532 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
dNTPs | Bioline | BIO-39025 | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aminoallyl-dUTP | Ambion | AM8439 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNA Polymerase I | New England Biolabs | M02095 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I recombinant RNase free | Roche | 4716728001 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Step 1.1.4, 1.2.3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaOAc | VWR | 27653 | Step 1.1.5, Step 2.1.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Step 1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications | Invitrogen (Molecular Probes) | A32750, A32756, A32757 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMSO (anhydrous) | Sigma Aldrich | 276855 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma | D7656 | Step 2.1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deionized formamide | Sigma | F-9037 | Step 2.1.1.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dextran sulphate | Sigma Life Sciences | D8906 | Step 2.1.1.4 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
XMP painting probes | MetaSystems | 000000-0528-837 | Step 2.1.1.4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Poly-L-lysine coated slides | Sigma Aldrich | P0425 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrophobic pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
70 μm sieve (Mouse fetal liver cells only) | BD Falcon | 352350 | Step 2.1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Sigma Aldrich | P6148 | Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tris-Cl | Step 2.1.3 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Saponin from Quillaja bark | Sigma Aldrich | 47036 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10 x PBS | Life Technologies (GIBCO) | 70011-036 | Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650 | Step 2.1.6 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HCl | VWR | 20252 | Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Formamide | Sigma Aldrich | 47670 | Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SSC | Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 22 | Menzel-Glaser | BB022022A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 50 | Menzel-Glaser | BB022050A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rubber cement | Marabu | 2901 (10 000) | Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DAPI | Invitrogen Molecular Probes | D3571 | Step 2.2.8 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | Step 2.2.10 (mounting medium) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Clear nail polish | Any supplier | Step 2.2.10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Typhoon FLA 7000 phosphoimager | GE Life Sciences | Step 1.2.4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coplin jars | Sigma-Aldrich | S6016 (6EA)/S5516 (6EA) | Step 2.1.3 onwards | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Liquid nitrogen dewar | Any supplier | Step 2.1.7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Base with Black Lid (light-tight chamber) | Simport | M920-2 | Step 2.1.17 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Imaging and Image processing | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafer – Imaging Automation Platform | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MetaCyte – Automated Interphase FISH analysis | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Axio Imager Z2 upright | Zeiss | epifluorescence microscope used with automated imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IX81 confocal microscope (FV1000) | Olympus | confocal microscope | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bitplane, version 7.3 | Imaris | image analysis and 3D modeling software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Scientific volume Imaging, version 4.1 | Huygens | image analysis and deconvolution software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
FISH buffers and reaction mixes
|