Generación de una nueva vacuna de células dendríticas usando melanoma y células madre escamosas del cáncer

1. Tinción de ALDEFLUOR Preparación de muestras celulares: Prepare la suspensión unicelular de células tumorales, ya sea de células tumorales cultivadas o de muestras de tumor recién recolectadas. Cuente las células y ajuste la suspensión celular a una concentración de 1 x 106 células/ml en el tampón de ensayo ALDEFLUOR. Etiquete cuatro tubos de ensayo de poliestireno de 12 mm x 75 mm como tubos de control de la siguiente manera: #1: No manchados, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR más DEAB, y #4: 7AAD. Para estos tubos de control, coloque la suspensión celular de 1 ml en #1 y #4, pero 2 ml en el tubo #2. Agregue 5 μl de DEAB (inhibidor de ALDH) en el tubo #3 y manténgalo en el hielo. A continuación, añadir 10 μl de sustrato ALDEFLUOR activado al tubo #2, mezclar y transferir inmediatamente 1 ml de la mezcla al tubo #3. Al mismo tiempo, añadir 2 μl de sustrato ALDEFLUOR activado por millón de células al resto de las células (tubos de muestra) también a 1 x 106 células/ml en el tampón de ensayo ALDEFLUOR. Incubar tanto los 4 tubos de control como los tubos de muestra durante 30 min en un baño de agua de 37 °C. Después de la incubación, agregue 5 μl 7AAD en el tubo de control #4, y 1 μl 7AAD 1 x 106 células al tubo de muestra. Incubar 10 min a 4 °C. Centrifugar todos los tubos durante 5 min a 250 x g y retirar el sobrenadante. Células resuspend en el buffer del ensayo de ALDEFLUOR. Realice la clasificación citología-basada del flujo. Establezca las puertas de clasificación utilizando células teñidas de ALDEFLUOR tratadas con DEAB como control negativo y las células teñidas de yoduro de propidio (PI) 7AAD- para el control de viabilidad. Sobre la base de estos controles, se estableció una puerta para distinguir las células ALDEFLUOR+/ALDHde alto,D5 y SCC7. Estas puertas se utilizarán para clasificar todas las células de muestra preparadas anteriormente para las células ALDEFLUOR+/ALDHaltas D5 y SCC7. 2. Preparación de la vacuna de células madre de células madre de células cancerosas de células dendríticas de pulso (CSC-TPDC) Eutanasia de ratones (singenéticos B6 y C3H, respectivamente) usando CO2 y aislar los huesos del fémur y la tibia. Ponga los huesos en etanol al 75% durante 1 min a temperatura ambiente. Luego lave los huesos usando HBSS. Corte la cabeza de los huesos y use una aguja de 21 G y una jeringa de 10 ml para empujar las células en un plato. Aspirar y soplar las células usando la jeringa para hacer la suspensión unicelular. Después de la centrifugación en 1.500 rpm durante 5 min, deseche el sobrenadante. A continuación, añadir 5 ml de tampón de lisis RBC a la lisis del RBC durante 1 min en un baño de agua de 37 °C. Cuente el número de células y ajuste la suspensión celular a una concentración de 1 millón de células/ml en medio completo (CM) que contenga 10 ng/ml GM-CSF y 10 ng/ml IL-4. Cultíe las células y compense el cm más IL-4 y GM-CSF 3 días más adelante. Al5º día, coseche las células dendríticas inmaduras (DC) y prepare el medio de aislamiento de CC que contiene 4,2 ml de solución C más 1 ml de medio de gradiente de densidad OptiPrep. Suspenda los pellets celulares en 5 ml CM. Añadir la suspensión celular en el medio de aislamiento lentamente. Centrífuga a 2.000 rpm a temperatura ambiente. Recoja los controladores de dominio entre el CM y el medio de aislamiento. Cuente el número de células y ajuste la suspensión celular a una concentración de 1 millón de células/ml en un medio de cultivo que contenga 10 ng/ml GM-CSF y 10 ng/ml IL-4. Prepare los lisatos tumorales suspendiendo las células D5 o SCC7altas o no clasificadas de ALDH en medio de cultivo y sujetas a exposiciones rápidas de congelación-descongelación cuatro veces seguidas de espín a ∼100 x g durante 5 min para recolectar la porción de membrana de los lisatos. Para preparar CSC-TPDC, pulse ADC con el lysate de célulasaltas autólogas de ALDH. Para preparar H-TPDC, pulse los CONTROLADORES DE DOMINIO con el lisato heterogéneo no clasificado de células tumorales. La proporción de DC a la célula tumorallysate es la misma. 3. Vacunación y evaluación de la eficacia Vacunar ratones B6 normales respectivamente con 2.500 células tumorales D5 CSC-TPDC o D5 H-TPDC por vía subcutánea(s.c.). Vacunar animales normales de C3H s.c. con 5.000 células tumorales SCC7 CSC-TPDC o SCC7 H-TPDC, respectivamente. Después de la vacunación, desafíe a los ratones B6 con las células heterogéneas del tumor D5 i.v. Euthanize los ratones usando elCO2 20 días más adelante. Cosechar los pulmones y enumerar las metástasis pulmonares. En el modelo SCC7, desafíe a los ratones C3H con células tumorales SCC7 s.c sin clasificar en el lado opuesto de la vacuna DC. Controle el tamaño del tumor. Al final de los experimentos eutanasia los ratones B6 y C3H utilizando CO2. En el día 34 después de la primera vacuna, eutanasia ratones con CO2,y al mismo tiempo recoger los bazos de cada grupo con un procedimiento aséptico. Active las células T y/o B del bazo con los mAb inmovilizados anti-CD3 más los mAbs anti-CD28 en el cm que contiene hrIL-2 o los LPS más las ascitis anti-CD40 (FGK45) del mAb. Después de la activación, recoger sobrenadantes y utilizar para el ensayo ELISA. Para el ensayo ELISA, recubre placas con anticuerpos para IFNγ, GM-CSF e IgG a 4 °C O/N. Después de la aplicación del tampón de bloqueo, agregue muestras y estándares e incube a temperatura ambiente. Lave la placa y agregue anticuerpos de detección de HRP y sustrato de TMB para la incubación. Mida la absorbancia en un lector de placas ELISA a 450 nm dentro de los 30 minutos después de detener la reacción.