JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Поколение новой дендритно-клеточной вакцины с использованием меланомы и плоскоклеточных раковых стволовых клеток

Published: January 06, 2014
doi:
10.3791/50561
, , , , , , , , ,
1Department of Surgery,University of Michigan, 2Department of Internal Medicine,University of Michigan, 3Department of Otolaryngology,University of Michigan

Summary

Оцененная в сингенетических иммунокомпетентных хозяев, рак стволовых клеток (CSC) на основе дендритных клеток (DC) вакцина продемонстрировала значительно более высокий противоопухольный иммунитет, чем традиционные вакцины DC пульсировал с неоднородными навалом опухолевых клеток.

Abstract

Мы определили раковые стволовые клетки (CSC)-обогащенные популяции от муриной меланомы D5 syngeneic до C57BL/6 мышей и плоскоклеточного рака SCC7 syngeneic к C3H мышей с использованием ALDEFLUOR/ALDH в качестве маркера, и проверили их иммуногенность, используя лизат клеток в качестве источника антигенов для пульса дендритических клеток (DCs). DCs пульсировал сALDH высокой CSC лизатов индуцированных значительно выше защитный противоопухольсийный иммунитет, чем ДК пульсировал с лизатами несортированных целых опухолевых клеток лизатов в обеих моделях и в легких метастазы настройки и s.c. настройки роста опухоли, соответственно. Это явление было связано с CSC вакцины индуцированной гуморальной, а также клеточных анти-CSC ответов. В частности, спеноциты, изолированные от хозяина, подвергаемого вакцине CSC-DC, производят значительно большее количество вакцины ИФНЗ и ГМ-CSF, чем спеноциты, изолированные от хозяина, подвергаемого несортированной опухолевой клетке лизат импульсной вакцины DC. Эти результаты поддерживают усилия по разработке аутологичной терапевтической вакцины на основе CSC для клинического использования в адъювантной обстановке.

Introduction

Раковые стволовые клетки относительно устойчивы к обычной химиотерапии илучевой терапии 1,2. С другой стороны, эта популяция клеток может быть клетки, ответственные за рецидив и прогрессирование рака после традиционнойтерапии рака 1-4. Из-за отсутствия выражения дифференцированных опухолевых антигенов на раковых стволовых клетках, раковые стволовые клетки могут избежать текущих иммунологических вмешательств терапии рака, которые в основном предназначены для целевой антигенов на дифференцированных опухолевых клеток. Таким образом, разработка новых стратегий, конкретно ориентированных и уничтожение раковых стволовых клеток может провести обещания по повышению терапевтической эффективности текущего лечения рака. С этой целью мы выделили раковые стволовые клетки (CSC) обогащенные популяции из двух опухолей животных (меланома D5 и плоскоклеточный рак SCC7), и использовали их в качестве источника антигена для импульсных антигенных клеток (дендритных клеток, DC) для подготовки вакцины CSC-TPDC. Затем мы оценили противоопухольный иммунитет, вызванный вакциной CSC-TPDC, в сингенных иммунокомпетентных организмах, мышах B6 и C3H соответственно. CSC-TPDC индуцированной противоопухолятельной эффективности был по сравнению с традиционной вакциной DC пульсировал с лизатом из несортированных неоднородных опухолевых клеток (H-TPDC), который ранее был использованнашей группой 5,6, а такжедругими следователями 7 как в доклинических исследованиях и в клинических испытаниях.

Protocol

1. АЛДЕФТОР Окрашивание Подготовка образца клетки: Подготовка одноклеточной суспензии опухолевых клеток, либо из культурных опухолевых клеток, либо из свежесобранной опухолевых образцов. Подсчитайте клетки и отрегулируйте подвес клетки к концентрации 1 x 106 клеток/мл в буфере анализа ALDEFLUOR. Этикетка четыре 12 мм х 75 мм полистирол пробирки в качестве контрольных труб следующим образом: #1: Unstained, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR плюс DEAB, и #4: 7AAD. Для этих контрольных труб, место 1 мл клеточной подвески в #1 и #4, но 2 мл в трубку #2. Добавьте 5 МКЛ DEAB (ингибитор ALDH) в трубчатые #3 и держите на льду. Затем добавьте 10 мкл активированного субстрата ALDEFLUOR в трубку #2, перемешайте и немедленно перенесите 1 мл смеси в трубчатую #3. В то же время, добавить 2 мкл активированных ALDEFLUOR субстрат на миллион клеток для остальных клеток (образцы труб) также на 1 х 106 клеток / мл в ALDEFLUOR Анализ буфера. Инкубировать как 4 контрольных труб и пробных труб в течение 30 мин в 37 градусов по Цельсию водяной бане. После инкубации добавьте 5 мкл 7AAD в контрольную трубку #4, и 1 мкл 7AAD 1 х 106 клеток в образец трубки. Инкубация 10 мин при 4 градусах Цельсия. Центрифуга все трубки в течение 5 мин при 250 х г и удалить супернатант. Повторное приостановление ячеек в ALDEFLUOR Assay Buffer. Выполняем сортировку на основе цитометрии потока. Установите ворота сортировки с использованием ALDEFLUOR-окрашенных клеток, обработанных DEAB как отрицательный контроль и йодидный пропидий (PI) 7AAD- окрашенные клетки для контроля жизнеспособности. На основе этих элементов управления были установлены ворота для различения ячеек ALDEFLUOR/ALDH высокой, D5 и SCC7. Эти ворота будут затем использоваться для сортировки всех образцов ячеек, подготовленных выше для ALDEFLUOR/ALDHвысоких D5 и SCC7 клеток. 2. Подготовка рака стволовых клеток лизировать-пульс Дендритической клетки (CSC-TPDC) Вакцина Эвтанизируйте мышей (сингенеические B6 и C3H, соответственно) с использованием CO2 и изолируйте кости бедренной кости и голени. Положите кости в 75% этанола в течение 1 мин при комнатной температуре. Затем мыть кости с помощью HBSS. Отрежьте голову кости и используйте 21 G иглы и 10 мл шприца, чтобы подтолкнуть клетки в блюдо. Аспирировать и взорвать клетки с помощью шприца, чтобы сделать одноклеточную подвеску. После центрифугации в 1500 об/мин в течение 5 минут, отбросить супернатант. Затем добавьте 5 мл буфера лиза РБК в лиз РБК в течение 1 мин в водяной бане 37 градусов по Цельсию. Подсчитайте количество клеток и отрегулируйте подвесную клетку до концентрации 1 миллиона клеток/мл в полной среде (CM), содержащей 10 нг/мл GM-CSF и 10 нг/мл IL-4. Культура клеток и компенсировать CM плюс IL-4 и GM-CSF 3 дня спустя. На5-й день, урожай незрелых дендритных клеток (DCs) и подготовить DC изоляции среды, содержащей 4,2 мл раствора C плюс 1 мл OptiPrep плотность градиента среды. Приостановить ячейки гранулы в 5 мл CM. Добавить подвеску клетки на изоляцию среды медленно. Центрифуга при температуре 2000 об/мин при комнатной температуре. Соберите DCs между CM и изоляционные среды. Подсчитайте номер клетки и отрегулируйте подвеску клетки к концентрации 1 миллиона клеток/мл в среде культуры содержа 10 ng/ml GM-CSF и 10 ng/ml IL-4. Подготовка опухолевых лизатов путем приостановки ALDHвысокой или несортированной D5 или SCC7 клеток в среде культуры и при условии быстрого замораживания оттепели воздействия четыре раза с последующим спина на ∼ 100 х г в течение 5 мин для сбора мембранной части лизатов. Для подготовки CSC-TPDC, импульсные DCs с лизатом аутологичной ALDH высокихклеток. Для подготовки H-TPDC, импульсные DCs с несортированной неоднородной лизации опухолевых клеток. Соотношение DC к ликату опухолевых клеток то же самое. 3. Вакцинация и оценка эффективности Вакцинировать нормальных мышей B6 соответственно с 2500 D5 CSC-TPDC или D5 H-TPDC опухолевых клетокподкожно ( s.c.). Вакцинировать нормальных животных C3H s.c. с 5000 SCC7 CSC-TPDC или SCC7 H-TPDC опухолевых клеток, соответственно. После вакцинации, вызов B6 мышей с неоднородными опухолевыми клетками D5 i.v. Euthanizeмышей с использованием CO 2 20 дней спустя. Урожай легких и перечислить метастазы легких. В модели SCC7, вызов C3H мышей с несортированной SCC7 опухолевых клеток s.c на противоположной стороне вакцины DC. Мониторинг размера опухоли. В конце экспериментов усытворяют мышей B6 и C3H с использованием CO2. На 34-й день после первой вакцины, усыпнять мышей с CO2, и в то же время собирать селезенки каждой группы с асептической процедурой. Активировать селезенку Т и/или В-клеток с обездвиженным анти-CD3 плюс анти-CD28 mAbs в CM, содержащих hrIL-2 или LPS плюс анти-CD40 (FGK45) mAb ascites. После активации собирайте супернатанты и используйте для анализа ELISA. Для анализа ELISA пластины пальто с антителами к ИФНЗ, ГМ-CSF и IgG при 4 градусах по Цельсию. После применения блокирующего буфера добавьте образцы и стандарты и инкубировать при комнатной температуре. Вымойте пластину и добавить антитела обнаружения HRP и TMB субстрат для инкубации. Измерьте абсорбанс на считыватель пластины ELISA на 450 нм в течение 30 минут после остановки реакции.

Representative Results

ALDEFLUOR/ALDH был использован в качестве единого маркера для изоляции стволовых клеток в нескольких злокачественныхновообразований 8-11. Мы определили популяции раковых стволовых клеток в двух опухолевых моделях D5 и SCC7, используя ALDEFLUOR в качестве маркера. Мы обнаружили клетки ALDEFLUOR в муриновой меланоме B16-D5 и плоскоклеточном раке SCC7. Мы обнаружили, что клетки ALDEFLUOR способствуют примерно 0,5% и 5,2% в культурных линиях опухолевых клеток D5 и SCC7,соответственно (рисунок 1). Свежесобранные опухолевые клетки из установленных опухолей были проанализированы, чтобы подтвердить существование клеток ALDEFLUOR. Как также показано на рисунке 1, было 2,5% и 4,2% клеток ALDEFLUOR из in vivo созданы D5 и SCC7 опухолей, соответственно. Опухолевые и самообъемляемость этих отсортированы D5 и SCC7 ALDEFLUOR/ALDH высоких популяций были оценены в сингенеических иммунокомпетентных хост, C57BL/6 и C3H мышей,соответственно 8. Мы использовали неоднородные несортированные опухолевые клетки лизировать импульсных DCs (H-TPDC) как в исследованиях на животных и вклинических испытаниях 5,6. Для изучения иммуногенности CSCs, мы выделили ALDH высокой CSC и импульсный DC с лизатом CSCs для генерируемых CSC-TPDC ( Рисунок2) и использовали H-TPDC в качестве обычного контроля вакцины против рака, чтобы проверить, если CSC-TPDC имеет какое-либо благотворное влияние в предотвращении роста опухоли. Мы оценили иммуногенность КСК, изучив защитный противоопухотьный иммунитет, вызванный CSC-TPDC. В модели D5 наивные иммунокомпетентные мыши были вакцинированы с.c с CSC-TPDC или H-TPDC (при том же лизате: коэффициент DC). Контрольные группы получили солевой раствор (PBS). Через неделю после последней вакцины, мышей были оспорены с несортированной D5 опухолевых клеток внутривенно(i.v.),и легкие были собраны 3 недели спустя, чтобы перечислить метастазы легких. Как показано в таблице 1, по сравнению с группой PBS, мышей, обработанных H-TPDC разработали меньше метастазов легких. Важно отметить, что мыши, обработанные CSC-TPDC, имели значительно меньше метастазов в легких, чем группа вакцин H-TPDC в обоих экспериментах. В модели SCC7, нормальные животные C3H были вакцинированы s.c с SCC7 CSC-TPDC или H-TPDC соответственно на правом фланге, после чего бросая вызов с несортированной SCC7 опухолевых клеток s.c в левый фланг. По сравнению с группой PBS, H-TPDC индуцированных скромный противоопухоло опухолевой иммунитет против роста опухоли. Тем не менее, было значительное ингибирование роста опухоли у мышей, которые лечились cSC-TPDC по сравнению с контрольной группой и группой H-TPDC (p<0.05, Рисунок 3). Эти результаты показывают, что CSCs могут быть использованы в качестве более эффективного источника антигена для загрузки DCs, чем традиционные несортированные опухолевые клетки в индуцировании защитного иммунитета против проблемы опухолевых клеток. Чтобы лучше понять механизмы, лежащие в основе наблюдаемого CSC-индуцированного защитного противоопухольного иммунитета, мы собрали селезенки от животных, подвергающихся прививкам от постоянного тока в конце экспериментов. Клетки селезенки были затем активированы анти-CD3/CD28/IL-2 или анти-CD3/CD28/IL-2 и LPS/anti-CD40. Затем были собраны культурные супернатанты для выявления экспрессии цитокинов и антител.  Значительно более высокие производства ИФНЗ и ГМ-CSF клетками селезенки от животных, вакцинированных D5 CSC-TPDC или SCC7 CSC-TPDC(рисунок 4). Кроме того, было значительно (р<0,05) выше IgG производства LPS/anti-CD40 активированных клеток селезенки, собранных из животных, вакцинированных с D5 CSC-TPDC или SCC7 CSC-TPDC по сравнению с D5 H-TPDC или SCC7 H-TPDC. Эти антитела были найдены, чтобы связать с D5 и SCC7 CSCs соответственно, и такая привязка может привести к лизу CSC в присутствиидополнения 8. Рисунок 1. Высокие популяции ALDHFLUOR/ALDH были обнаружены в культурных, а также недавно собранных свежих меланомы мурина D5 и SCC7 плоскоклеточных опухолей. Опухолевые клетки, обработанные 50 ммоль/Л DEAB, специфический ингибитор ALDH, были использованы в качестве отрицательного контроля. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.  Рисунок 2. Поколение дендритных клеточных вакцин против рака стволовых клеток. Для подготовки CSC-TPDC и H-TPDC, дендритные клетки костного мозга были импульсными с ALDH высокой или несортированной лизатами опухолевых клеток, соответственно. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.  Рисунок 3. Вакцина CSC lysate pulsed DC (CSC-TPDC) может вызвать более эффективный защитный противоопухоотьный иммунитет в .c. Модель опухоли SCC7. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.  Рисунок 4. Более мощные системные клеточные реакции при иммунокомпетентном хосте, вакцинированном CSC-TPDC.  Спеноциты были собраны у животных, подвергаемых вакцинации H-TPDC или CSC-TPDC, и были активированы, как указано. Затем для обнаружения цитокинов с помощью ELISA были собраны культурные супернатанты. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. 

Discussion

Иммунокомпромиссные хозяева, такие как мыши SCID, исключают иммунологические оценки ККС из-за отсутствия адаптивного иммунитета у хозяев. В этом исследовании мы оценили иммуногенность КСК в иммунокомпетентных хозяев, которые могли бы более тесно имитировать настройки пациента. Обогащенные ККС являются иммуногенными и могут вызвать более эффективный защитный иммунитет опухоли, когда их лизаты загружаются в ДК в качестве вакцины по сравнению с невыбранными опухолевыми клетками лизат-пульсом ДК.  Механистически, защита была предоставлена путем селективной индукции CSC-реактивных антител иТ-клеток 8, а также производство цитокинов типа 1, например, ИФНЗ и ГМ-CSF.

Большинство современных иммунотерапии, включая дендритные клеточные вакцины и приемную передачу Т-клеток, предназначены для целевых опухолевых дифференцированных антигенов. CSCs, которые не могут выразить эти дифференцированные антигены могут поэтому избеубежать эти иммунологические пристрелить. В отличие от этого, вакцина CSC предназначена специально для целевых раковых стволовых клеток может уничтожить эту особую популяцию раковых клеток, и тем самым улучшить терапевтическую эффективность вакцины путем предотвращения рецидива опухоли и метастазов.

Как в культурных опухолевых клетках, так и в свежесобранных опухолях мы определили обогащенную CSC популяцию по цитометрии потока на основе высокой активности дегидрогеназы альдегида. Такие ALDHвысокие клетки могут быть изолированы путем сортировки потока, которые будут использоваться в качестве источника антигена для импульса DC для создания CSC-TPDCs. Сравнение с использованием ALDH высоких клеток, изолированных от культурных опухолевых клеток против свежесобранные опухоли показали никакой существенной разницы в срок индукции анти-CSCиммунитет 8. Эти результаты показали потенциал для использования CSCs изолированы либо от культурных опухолевых клеток или от свежесобранных опухолей для клинического применения.

Чтобы быть клинически актуальным, вакцина должна быть рассмотрена в терапевтических условиях. Эти эксперименты сейчас проводятся в нашей лаборатории.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Уилл и Джин Колдуэлл наделенный научно-исследовательский фонд Мичиганского университета Всеобъемлющего онкологического центра и, в частности, NIH грант CA82529 и Фонд Гиллсона Лонгенбо.

Materials

ALDHEFLOUR KIT Stemcell Technologies 1700
Murine IL-4 Pepro Tech 214-14
Murine GM-CSF Pepro Tech 315-03
Mouse IFN-ɣ ELISA KIT BD Biosciences 555138
Mouse GM-CSF ELISA KIT BD Biosciences 555167
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma Aldrich D1556
BD OptEIA TMB Substrated Reagent Set BD Biosciences 555214
Equipment
BD FACS Aria Cell Sorter BD Biosciences 336834
Kcjunior Bio-Tek Instruments 176058
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shafee, N., Smith, C. R., et al. Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors. Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).
  2. Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells. Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).
  3. Dallas, N. A., Xia, L., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).
  4. Yamauchi, K., Yang, M., et al. Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy. Cancer Res. 68, 516-520 (2008).
  5. Chang, A. E., Redman, B. G., et al. A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer. Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).
  6. Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines. Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).
  7. Kirk, C. J., Hartigan-O’Connor, D., et al. T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy. Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).
  8. Ning, N., Pan, Q., et al. Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity. Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).
  9. Ginestier, C., Liu, S., et al. CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts. J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).
  10. Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer. Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).
  11. Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature. Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).

Tags

Cancer Stem CellsDendritic Cell VaccineMelanomaSquamous CancerALDHAntitumor ImmunityIFN-γGM-CSF

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Li, Q., Lu, L., Tao, H., Xue, C., Teitz-Tennenbaum, S., Owen, J. H., Moyer, J. S., Prince, M. E., Chang, A. E., Wicha, M. S. Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells. J. Vis. Exp. (83), e50561, doi:10.3791/50561 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image