黒色腫と扁平上癌幹細胞を用いた新規樹状細胞ワクチンの生成

1. アルデフルオール染色 細胞サンプル調製:培養腫瘍細胞または採取したばかりの腫瘍サンプルから、腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を調製する。細胞を数え、ALDEFLUORアッセイバッファー内の1 x 106 細胞/mlの濃度に細胞懸濁液を調整します。 コントロールチューブとして4つの12 mm x 75 mmポリスチレン試験管をラベル:#1:アンステイン、#2:アルデフルオール、#3:アルデフルオール+DEAB、および#4:7AAD。 これらのコントロールチューブの場合は、1mlの細胞懸濁液を#1に入れ、#4し、チューブ#2に2mlを入れる。5 μl DEAB (ALDH阻害剤) をチューブ#3に加え、氷の上に保管します。その後、チューブ#2に10μl活性化ALDEFLUOR基質を加え、混合し、すぐに1mlの混合物をチューブ#3に移します。 同時に、ALDEFLUORアッセイバッファー内の1 x 106細胞/mlの細胞(サンプルチューブ)の残りの部分にも、100万個当たりの活性化ALDEFLUOR基質を2μl添加します。 4つのコントロールチューブとサンプルチューブの両方を37°Cの水浴で30分間インキュベートします。 インキュベーションに続いて、5 μl 7AADをコントロールチューブ#4に加え、サンプルチューブに1 μl 7AAD 1 x 106 細胞を加えます。4°Cで10分インキュベート。 250 x g で 5 分間すべてのチューブを遠心分離し、上清を除去します。 ALDEFLUORアッセイバッファー内の細胞を再懸濁します。 フローサイトメトリーベースのソートを実行します。 DEABを負の対照として処理したALDEFLUOR染色細胞と、生存率制御のためのヨウ化プロピジウム(PI)7AAD-染色細胞を用いて選別ゲートを設定する。これらのコントロールに基づいて、ALDEFLUOR+/ALDH高、D5およびSCC7細胞を区別するゲートが確立された。これらのゲートは、ALDEFLUOR+/ALDH高D5 およびSCC7細胞のために上記で調製されたすべてのサンプル細胞をソートするために使用されます。 2. がん幹細胞リセートパルス樹状細胞(CSC-TPDC)ワクチンの調製 CO2を用いてマウス(それぞれ同種B6およびC3H)を安楽死させ、大腿骨および脛骨を単離する。 室温で1分間、骨を75%エタノールに入れます。その後、HBSSを使用して骨を洗います。 骨を切り落とし、21G針と10mlの注射器を使って細胞を皿に押し込みます。 吸引し、単一細胞懸濁液を作るために注射器を使用して細胞を吹き飛ばす。 1,500rpmで5分間遠心分離した後、上清を捨てます。その後、RBCのリシスバッファーに5mlのRBCを加え、37°Cの水浴中に1分間RBCをライシスします。 細胞数をカウントし、10 ng/ml GM-CSFおよび10 ng/ml IL-4を含む完全培地(CM)中の100万細胞/mlの濃度に細胞懸濁液を調整する。 細胞を培養し、3日後にCMプラスIL-4およびGM-CSFを補償する。 5日目 に、未熟樹状細胞(DC)を収穫し、4.2 ml溶液Cプラス1 ml OptiPrep濃度勾配培地を含むDC分離培地を調製する。 5 ml CM で細胞ペレットを懸濁し、細胞懸濁液を分離培地にゆっくり加えます。室温で2,000rpmで遠心分離機。 CM と分離メディアの間の DC を収集します。細胞数をカウントし、10 ng/ml GM-CSFおよび10ng/ml IL-4を含む培地中の100万個の細胞/mlの濃度に細胞懸濁液を調整する。 ALDH高 または未ソートのD5またはSCC7細胞を培地中に懸濁させて腫瘍ライセートを調製し、その後5分間°100 x gでスピンを行い、ライセートの膜部分を回収します。 CSC-TPDCを調製するために、自己ALDH高細胞のライセートを用いてDCをパルスする。H-TPDCを調製するために、不均一な異種腫瘍細胞リセートを有するパルスDC。DCと腫瘍細胞のライセートの比率は同じである。 3. 有効性のワクチン接種と評価 正常B6マウスを2,500D5 CSC-TPDCまたはD5 H-TPDC腫瘍細胞を皮下(s.c)でそれぞれワクチンを接種する。正常なC3H動物 をワクチン 接種.c 5,000 SCC7 CSC-TPDCまたはSCC7 H-TPDC腫瘍細胞をそれぞれ有する。 ワクチン接種後、20日後にCO2を用いてマウスを安楽死させる異種D5腫瘍細胞を有するB6マウスに挑戦する。肺を収穫し、肺の転移を列挙する。 SCC7モデルでは、DCワクチンの反対側に未分類のSCC7腫瘍細胞 s.c を有するC3Hマウスに挑戦する。腫瘍のサイズを監視します。 実験の最後にCO2を用いてB6マウスとC3Hマウスを安楽死させる。最初のワクチンの後34日目に、CO2でマウスを安楽死させ、同時に無菌処置で各群の脾臓を採取する。 hrIL-2 または LPS プラス抗 CD40 (FGK45) mAb 腹水を含む CM で固定化抗 CD3 プラス抗 CD28 mAbs を使用して脾臓 T および/または B 細胞を活性化します。 活性化後、上清を収集し、ELISAアッセイに使用してください。 ELISAアッセイの場合、IFNγ、GM-CSFおよびIgGの抗体を4°C O/Nでコートします。 ブロッキングバッファーの適用後、サンプルと標準を追加し、室温でインキュベートします。 プレートを洗浄し、インキュベーション用のHRP検出抗体とTMB基質を添加します。 反応を停止した後、30分以内に450 nmのELISAプレートリーダーの吸光度を測定します。