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Immunology and Infection

Generazione di un nuovo vaccino a cellule dendritiche con melanoma e cellule staminali tumorali squamose

Published: January 06, 2014
doi:
10.3791/50561
, , , , , , , , ,
1Department of Surgery,University of Michigan, 2Department of Internal Medicine,University of Michigan, 3Department of Otolaryngology,University of Michigan

Summary

Valutato in ospiti immunocompetenti sigeneici, il vaccino a cellule dendritiche (DC) a base di cellule staminali tumorali (CSC) ha dimostrato un’immunità antitumorale significativamente più elevata rispetto ai tradizionali vaccini CC pulsati con cellule tumorali alla rinfusa eterogenee.

Abstract

Abbiamo identificato le popolazioni arricchite di cellule staminali tumorali (CSC) dai topi murini melanoma D5 sigeneici a C57BL/6 e il cancro squamoso da SCC7 sigeneico a topi C3H usando ALDEFLUOR/ALDH come marcatore e ne abbiamo testato l’immunogenicità usando il lisato cellulare come fonte di antigeni per pulsare le cellule dendritiche (DC). I DC pulsati con glisatiALDH ad alto CSC hanno indotto un’immunità antitumorale protettiva significativamente più elevata rispetto ai DCs pulsati con i liti di liti di cellule tumorali intere nonsortite in entrambi i modelli e in un ambiente di metastasi polmonare e un s.c. crescita tumorale, rispettivamente. Questo fenomeno era dovuto alle risposte umoriali indotte dal vaccino CSC e alle risposte anti-CSC cellulari. In particolare, gli splenociti isolati dall’ospite sottoposti a vaccino CSC-DC hanno prodotto una quantità significativamente maggiore di IFNγ e GM-CSF rispetto agli splenociti isolati dall’ospite sottoposti a vaccino a impulsi-DC a cellule tumorali nonsorte. Questi risultati supportano gli sforzi per sviluppare un vaccino terapeutico autologo a base di CSC per uso clinico in un ambiente adiuvante.

Introduction

Le cellule staminali tumorali sono relativamente resistenti alla chemioterapia convenzionale e alla radioterapia1,2. D’altra parte, questa popolazione di cellule potrebbe essere le cellule responsabili della ricaduta e della progressione dei tumori dopo le terapie oncologichetradizionali 1-4. A causa della mancanza di espressione di antigeni tumorali differenziati sulle cellule staminali tumorali, le cellule staminali tumorali possono sfuggire agli attuali interventi immunologici della terapia per il cancro, che sono per lo più progettati per colpire gli antigeni sulle cellule tumorali differenziate. Pertanto, lo sviluppo di nuove strategie specificamente mirate e distruggono le cellule staminali tumorali può mantenere promesse di aumentare l’efficacia terapeutica dell’attuale trattamento del cancro. A tal fine, abbiamo isolato le popolazioni arricchite di cellule staminali tumorali (CSC) da due tumori animali (melanoma D5 e cancro delle cellule squamose SCC7), e le abbiamo utilizzate come fonte di antigene per pulsare le cellule che presentano l’antigene (cellule dendritiche, DC) per preparare il vaccino CSC-TPDC. Abbiamo quindi valutato l’immunità antitumorale indotta dal vaccino CSC-TPDC negli ospiti immunocompetenti sigeneici, nei topi B6 e nei topi C3H rispettivamente. L’efficacia antitumore indotta dal CSC-TPDC è stata confrontata con il tradizionale vaccino CC pulsato con lisato da cellule tumorali eterogenee nonsortite (H-TPDC), che è stato precedentemente utilizzato dalnostro gruppo 5,6, nonché da altriricercatori 7 sia in studi preclinici che in studi clinici.

Protocol

1. Colorazione ALDEFLUOR Preparazione del campione cellulare: Preparare la sospensione a singola cellula delle cellule tumorali, sia da cellule tumorali coltivate o da campioni di tumore appena raccolti. Contare le cellule e regolare la sospensione cellulare a una concentrazione di 1 x 106 celle/ml nel tampone di dosaggio ALDEFLUOR. Etichettare quattro provette in polistirolo da 12 mm x 75 mm come provette di controllo come segue: #1: Non macchiato, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR più DEAB e #4: 7AAD. Per questi tubi di controllo, posizionare 1 ml di sospensione cellulare #1 e #4, ma 2 ml nel tubo #2. Aggiungere 5 μl DEAB (inibitore ALDH) nel tubo #3 e tenere sul ghiaccio. Quindi aggiungere 10 μl di substrato ALDEFLUOR attivato al tubo #2, mescolare e trasferire immediatamente 1 ml della miscela al tubo #3. Allo stesso tempo, aggiungere 2 μl di substrato ALDEFLUOR attivato per milione di cellule al resto delle cellule (tubi campione) anche a 1 x 106 celle/ml nel tampone di dosaggio ALDEFLUOR. Incubare sia i 4 tubi di controllo che i tubi campione per 30 minuti in bagno d’acqua a 37 °C. Dopo l’incubazione, aggiungere 5 μl 7AAD nel tubo di controllo #4 e 1 μl 7AAD 1 x 106 celle al tubo campione. Incubare 10 min a 4 °C. Centrifugare tutti i tubi per 5 minuti a 250 x g e rimuovere il supernatante. Cellule resuspend nel tampone di dosaggio ALDEFLUOR. Eseguire l’ordinamento basato sulla citometria a flusso. Impostare i cancelli di smistamento utilizzando celle macchiate di ALDEFLUOR trattate con DEAB come controllo negativo e le celle macchiate di propididio (PI) 7AAD per il controllo della vitalità. Sulla base di questi controlli, è stato istituito un cancello per distinguere le cellule ALDEFLUOR+/ALDHhigh,D5 e SCC7. Questi cancelli verranno quindi utilizzati per ordinare tutte le celle campione preparate sopra per le celle ALDEFLUOR+/ALDHhigh D5 e SCC7. 2. Preparazione del vaccino contro le cellule staminali tumorali a impulsi dendritici a impulsi (CSC-TPDC) Eutanasia dei topi (sigeneico B6 e C3H, rispettivamente) usando CO2 e isolare femore e ossa di tibia. Mettere le ossa in etanolo al 75% per 1 minuto a temperatura ambiente. Quindi lavare le ossa usando HBSS. Tagliare la testa dalle ossa e utilizzare un ago da 21 G e una siringa da 10 ml per spingere le cellule in un piatto. Aspirare e soffiare le cellule usando la siringa per effettuare la sospensione a singola cella. Dopo la centrifugazione in 1.500 giri/min per 5 minuti, scartare il supernatante. Quindi aggiungere 5 ml di tampone di lisi RBC per lisiizzare l’RBC per 1 min in bagno d’acqua a 37 °C. Contare il numero di cellule e regolare la sospensione cellulare ad una concentrazione di 1 milione di cellule/ml in mezzo completo (CM) contenente 10 ng/ml DI GM-CSF e 10 ng/ml IL-4. Coltura delle cellule e compensazione CM più IL-4 e GM-CSF 3 giorni dopo. Al5 ° giorno, raccogliere le cellule dendritiche immature (DC) e preparare il mezzo di isolamento CC contenente 4,2 ml di soluzione C più 1 ml di mezzo gradiente di densità OptiPrep. Sospendere lentamente il pellet di cella in CM da 5 ml. Centrifuga a 2.000 giri/min a temperatura ambiente. Raccogliere i TC tra il CM e il supporto di isolamento. Contare il numero di cellule e regolare la sospensione cellulare ad una concentrazione di 1 milione di cellule/ml in un mezzo di coltura contenente 10 ng/ml di GM-CSF e 10 ng/ml IL-4. Preparare i lisati tumorali sospendendo le celluleALDH D5 o SCC7 alte o nonsorte nel terreno di coltura e soggette a esposizioni rapide di congelamento-disgelo quattro volte seguite da spin a ∼100 x g per 5 minuti per raccogliere la porzione di membrana dei lisati. Per preparare CSC-TPDC, pulsare i CD con il lysate delle cellule alteALDH autologhe. Per preparare h-TPDC, i PC a impulsi con lisato di cellule tumorali eterogenee nonsortite. Il rapporto tra DC e il llysato delle cellule tumorali è lo stesso. 3. Vaccinazione e valutazione dell’efficacia Vaccinare i normali topi B6 rispettivamente con 2.500 cellule tumorali D5 CSC-TPDC o D5 H-TPDC per via sottocutanea (s.c.). Vaccinare i normali animali C3H s.c. con 5.000 cellule tumorali SCC7 CSC-TPDC o SCC7 H-TPDC, rispettivamente. Dopo la vaccinazione, sfida i topi B6 con le cellule tumorali D5 eterogenee, cioè eutanasia i topi usando CO2 20 giorni dopo. Raccogliere i polmoni ed enumerare le metastasi polmonari. Nel modello SCC7, sfida i topi C3H con cellule tumorali SCC7 non .c sul lato opposto del vaccino DC. Monitorare le dimensioni del tumore. Al termine degli esperimenti eutanasiare i topi B6 e C3H utilizzando CO2. Al giorno 34 dopo il primo vaccino, eutanasiare i topi con CO2e allo stesso tempo raccogliere le milza di ogni gruppo con una procedura aseptica. Attivare celle T e/o B milza con ascite anti-CD3 immobilizzate più anti-CD28 mAb in CM contenenti hrIL-2 o LPS più ascite anti-CD40 (FGK45) mAb. Dopo l’attivazione, raccogliere i supernatanti e utilizzarli per il test ELISA. Per il test ELISA, rivestire piastre con anticorpi per IFNγ, GM-CSF e IgG a 4 °C O/N. Dopo l’applicazione del tampone di blocco, aggiungere campioni e standard e incubare a temperatura ambiente. Lavare la piastra e aggiungere anticorpi di rilevamento HRP e substrato TMB per l’incubazione. Misurare l’assorbanza su un lettore di piastre ELISA a 450 nm entro 30 minuti dopo aver interrotto la reazione.

Representative Results

ALDEFLUOR/ALDH è stato utilizzato come singolo marcatore per isolare le cellule staminali in molteplici neoplasiemaligne 8-11. Abbiamo identificato popolazioni arricchite di cellule staminali tumorali in due modelli tumorali D5 e SCC7 usando ALDEFLUOR come marcatore. Abbiamo rilevato cellule ALDEFLUOR+ nel melanoma murino B16-D5 e nel cancro delle cellule squamose SCC7. La Corte ha riscontrato che le cellule ALDEFLUOR+ contribuiscono rispettivamente a circa lo 0,5% e il 5,2% nelle linee cellulari tumorali D5 e SCC7 coltivate (Figura 1). Le cellule tumorali appena raccolte da tumori affermati sono state analizzate per confermare l’esistenza delle cellule ALDEFLUOR+. Come mostrato anche nella figura 1, c’erano rispettivamente il 2,5% e il 4,2% delle cellule ALDEFLUOR+ provenienti da tumori D5 e SCC7 stabiliti in vivo. L’genicità dei tumori e la capacità di autorilu rinnovamento di queste popolazioni elevate ordinate D5 e SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH sono state valutate nell’ospite immunocompetente sigeneico, i topi C57BL/6 e C3H,rispettivamente 8. Abbiamo usato lisato di cellule tumorali eterogenee non disomogenee per pulsare i DC (H-TPDC) sia negli studi sugli animali che negli studi clinici5,6. Per esaminare l’immunogenicità dei CSC, abbiamo isolato l’ALTOCSC di ALDH e il CC pulsato con il lisato dei CSC al CSC-TPDC generato (Figura 2) e abbiamo utilizzato H-TPDC come controllo convenzionale del vaccino contro il cancro per verificare se CSC-TPDC ha qualche effetto benefico nel prevenire la crescita del tumore. Abbiamo valutato l’immunogenicità dei CSC esaminando l’immunità protettiva antitumorale indotta dal CSC-TPDC. Nel modello D5, i topi immunocompetenti ingenui sono stati vaccinati s.c con CSC-TPDC o H-TPDC (allo stesso rapporto lysate: DC). I gruppi di controllo hanno ricevuto saline (PBS). Una settimana dopo l’ultimo vaccino, i topi sono stati sfidati con cellule tumorali D5 nonsortite pervia endovenosa ( v.v.), e ipolmoni sono stati raccolti 3 settimane dopo per enumerare le metastasi polmonari. Come mostrato nella tabella 1, rispetto al gruppo PBS, i topi trattati con l’H-TPDC hanno sviluppato meno metastasi polmonari. È importante sottolineare che i topi trattati con CSC-TPDC avevano significativamente meno metastasi polmonari rispetto al gruppo vaccinale H-TPDC in entrambi gli esperimenti eseguiti. Nel modello SCC7, i normali animali C3H sono stati vaccinati s.c con SCC7 CSC-TPDC o H-TPDC rispettivamente sul fianco destro, seguiti da sfide con cellule tumorali SCC7 nonsortite s.c sul fianco sinistro. Rispetto al gruppo PBS, H-TPDC ha indotto una modesta immunità antitumorale contro la crescita tumorale. Tuttavia, c’è stata una significativa inibizione della crescita tumorale nei topi che sono stati trattati con CSC-TPDC rispetto sia al gruppo di controllo che al gruppo H-TPDC (p<0.05, Figura 3). Questi risultati indicano che i CSC potrebbero essere utilizzati come fonte di antigene più efficace per caricare i PC rispetto alle tradizionali cellule tumorali nonsortite nell’indurre l’immunità protettiva contro la sfida delle cellule tumorali. Per comprendere ulteriormente i meccanismi alla base dell’immunità protettiva antitumorale indotta dal CSC osservata, abbiamo raccolto le milza dagli animali sottoposti a vaccinazioni CC alla fine degli esperimenti. Le cellule di milza sono state poi attivate da anti-CD3/CD28/IL-2 o anti-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anti-CD40. Quindi i supernatici di coltura sono stati raccolti per rilevare l’espressione di citochine e anticorpi.  Le produzioni di IFNγ e GM-CSF da parte delle cellule di milza provenienti dagli animali vaccinati con D5 CSC-TPDC o SCC7 CSC-TPDC(Figura 4)sono state significativamente più elevate. Inoltre, la produzione di IgG da parte delle cellule di milza attivate LPS/anti-CD40 è stata significativamente (p<0,05) aumentata rispetto a D5 H-TPDC o SCC7 H-TPDC rispetto a D5 H-TPDC o SCC7 H-TPDC. Questi anticorpi si sono dati legare rispettivamente ai CSC D5 e SCC7 e tale legame potrebbe comportare la lisi CSC in presenza delcomplemento 8. Figura 1. Alte popolazioni di ALDHFLUOR+/ALDH sono state rilevate in tumori delle cellule squamose coltivati e di nuova raccolta di melanoma murino D5 e SCC7. Le cellule tumorali trattate con 50 mmol/L DEAB, uno specifico inibitore dell’ALDH, sono state utilizzate come controllo negativo. Clicca qui per visualizzare l’immagine più grande.  Figura 2. Generazione di vaccini contro le cellule staminali tumorali a base di cellule dendritiche. Per la preparazione di CSC-TPDC e H-TPDC, le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo sono state pulsate rispettivamente con liti delle cellule tumorali alte o nonsortiteALDH. Clicca qui per visualizzare l’immagine più grande.  Figura 3. Il vaccino csc lysate cc pulsato (CSC-TPDC) potrebbe indurre un’immunità protettiva antitumorale più efficace nel s.c. Modello tumorale SCC7. Clicca qui per visualizzare l’immagine più grande.  Figura 4. Risposte cellulari sistemiche più potenti nell’ospite immunocompetente vaccinato con CSC-TPDC.  Gli splenociti sono stati raccolti dagli animali sottoposti a vaccinazione H-TPDC o CSC-TPDC e sono stati attivati come indicato. I supernatici di coltura sono stati quindi raccolti per il rilevamento delle citochine utilizzando ELISA. Clicca qui per visualizzare l’immagine più grande. 

Discussion

Gli ospiti immunocomprosibili, come i topi SCID, impediscono valutazioni immunologiche dei CSC a causa della mancanza di immunità adattiva all’interno degli ospiti. In questo studio, abbiamo valutato l’immunogenicità dei CSC negli ospiti immunocompetenti, che potrebbe imitare più da vicino le impostazioni del paziente. I CSC arricchiti sono immunogenici e potrebbero indurre un’immunità protettiva tumorale più efficace quando i loro lisati vengono caricati nei DC come vaccino rispetto ai DC pulsati a cellule tumorali non selezionati.  Meccanicamente, la protezione è stata conferita dall’induzione selettiva di anticorpi reattivi CSC e cellule T8, nonché dalla produzione di citochine di tipo 1, ad esempio IFNγ e GM-CSF.

La maggior parte delle attuali immunoterapie, compresi i vaccini a base di cellule dendritiche e il trasferimento adottivo delle cellule T, sono progettate per colpire gli antigeni differenziati per il tumore. I CSC, che non possono esprimere questi antigeni differenziati, possono quindi sfuggire a questi obiettivi immunologici. Al contrario, il vaccino CSC progettato per colpire specificamente le cellule staminali tumorali può distruggere questa popolazione speciale delle cellule tumorali, e quindi migliorare l’efficacia terapeutica del vaccino prevenendo la ricaduta e la metastasi tumorale.

Sia nelle cellule tumorali coltivate che nei tumori appena raccolti, abbiamo identificato la popolazione arricchita di CSC dalla citometria a flusso basata sull’alta attività dell’aldeide deidrogenasi. Tali cellule alteALDH potrebbero essere isolate dallo smistamento del flusso da utilizzare come fonte di antigene per pulsare DC per generare CSC-TDC. Il confronto con cellule alteALDH isolate da cellule tumorali coltivate rispetto ai tumori appena raccolti non ha dimostrato alcuna differenza significativa in termini di induzione dell’immunità anti-CSC8. Questi risultati hanno rivelato il potenziale di utilizzare CSC isolati da cellule tumorali coltivate o da tumori appena raccolti per l’applicazione clinica.

Per essere clinicamente rilevante, un vaccino deve essere esaminato in un contesto terapeutico. Questi esperimenti vengono ora eseguiti nel nostro laboratorio.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da The Will e Jeanne Caldwell Endowed Research Fund dell’University of Michigan Comprehensive Cancer Center e in parte dalla sovvenzione NIH CA82529 e dalla Gillson Longenbaugh Foundation.

Materials

ALDHEFLOUR KIT Stemcell Technologies 1700
Murine IL-4 Pepro Tech 214-14
Murine GM-CSF Pepro Tech 315-03
Mouse IFN-ɣ ELISA KIT BD Biosciences 555138
Mouse GM-CSF ELISA KIT BD Biosciences 555167
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma Aldrich D1556
BD OptEIA TMB Substrated Reagent Set BD Biosciences 555214
Equipment
BD FACS Aria Cell Sorter BD Biosciences 336834
Kcjunior Bio-Tek Instruments 176058
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References

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Li, Q., Lu, L., Tao, H., Xue, C., Teitz-Tennenbaum, S., Owen, J. H., Moyer, J. S., Prince, M. E., Chang, A. E., Wicha, M. S. Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells. J. Vis. Exp. (83), e50561, doi:10.3791/50561 (2014).
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