从胚胎斑马鱼的毛特纳细胞膜片钳记录

以上所述的协议允许一个从M-细胞和其同系物的膜片钳记录。该技术是具有挑战性的，并应注意在整个过程中采取的几个关键领域。现在，我们将讨论一些这些方面的，并会提供有用的提示，以确保成功。

解剖/录音室的结构是本实验的一个重要方面。对M-细胞是很难看到，除非微分干涉对比使用。利用Nomarski DIC效果最好用干净的玻璃盖玻片上，但是我们已经发现，非常薄的层的Sylgard（〜1-2毫米），不会扭曲DIC在于，它与识别的M细胞的干扰的程度。因此，我们使用一个记录腔室具有在底部有一个薄的玻璃盖玻片上，其上放置了一个小的塑料垫圈（〜5毫米直径）。我们在培养皿中混合的Sylgard 184和仔细的液体的Sylgard加至用巴氏吸管将垫圈的内侧。在施lgard可以在室温下固化超过几天或可加热的快速固化。垫圈可后的Sylgard固化去除，尽管这不是必需的。一旦剥离/记录室已经作出，它可以用于几个星期一个新鲜的Sylgard内衬载玻片之前需要。

此过程中的下一步是弥补所有的实验（ 表3）当日的相关解决方案。包含的一切，但ATP和GTP的细胞内溶液在-20℃下制成提前并存储在5ml等分上记录的一天的等分试样解冻至室温，新鲜的ATP和GTP被添加。将溶液调节至280毫渗透摩尔浓度和pH为7.4。在我们手中，我们发现，除了新鲜的ATP和GTP每天产生良好的录音。所有的解决方案需要保持无菌成功的最佳机会。

细胞内的解决方案必须经过过滤throug公顷0.22微米的过滤器（Sigma公司），以去除小颗粒和碎片，可能会影响录音。要做到这一点，我们首先绘制细胞内溶液倒入1毫升注射器，加盖过滤器，注射器的末尾，添加一个塑料吸管尖端的加热并拉至精尖，到过滤器的末尾。这使得我们可以直接将过滤后的细胞内溶液的玻璃补丁移液器的内部。

一旦解决方案准备，胚胎可被麻醉，解剖。在此之前的夹层，应注意充分评估生物体的时代。在离合器年龄每个胚胎在一个稍微不同的速率。因此，评估生物的年龄时，这样做的根据既定程序^10,13，通过利用表型线索，如体节的数量，身体的整体形状和卵子受精的时间是很重要的。所有的解剖与一个杜蒙＃5细对执行镊子。这些需要是尖锐，处于良好的工作状态，否则这将是非常难以去除的皮肤覆盖在后脑的腹面的后脑和任何结缔组织。我们经常要锐化镊子几个星期的使用后，做自己该用磨石。

到脚鱼薄层SYLGARD的，我们用针从细钨丝0.001英寸直径塑造。该引脚切断与旧，显微解剖解剖显微镜下剪刀，并有足够的小，以适应的权利，通过脊索。钢钉胚胎在任何其他点不固定它们，使夹层几乎不可能完成。当第一次学习来执行记录，也可以是难以从它的同系物的同一性的M-细胞（特别是MID2厘米，位于相邻的菱 – 菱5）。在某些胚胎这两对细胞的出现在大小相似。耳石亲韦迪一个方便的地标在M-细胞的识别提供帮助。在48 HPF的M细胞位于旁边的耳石，即使耳石解剖过程中删除，他们的后脑轻微受损的横向区域，作为一个标记为原来的位置，身后离开。表达GFP或一些其它荧光标记物中的M-细胞的转基因鱼，提供优良的准备新实验者。在我们手中的M-细胞具有约18-24 pF的膜电容在48个高倍视野，而较小的同系物是接近12-14 pF的。较小的细胞相比，细胞具有更大的表面积有较大的膜的电容值（在微微法拉（PF）测量）。因此，膜电容可以作为泡孔尺寸，其中较大的细胞具有更大的电容值的粗略指标。此电特性作为另一属性由该M-细胞可以从它的同系物进行识别。最后，我们经常使用鲁cifer黄色在我们的记录（细胞内）解决方案，它允许我们使用荧光成像一次录音是完全受调查进行坚决鉴定细胞类型。

在3.5-4.5MΩ范围的枪头电阻是烙铁头尺寸和低接入电阻，一般为8〜15MΩ之间的最佳折衷。这是为了与快速动力学事件尤其重要;〜0.1毫秒（20-80％）的上升时间和〜0.5毫秒呈指数衰减^12,14,15（ 图3A和3B）。获取在50-100 kHz的数字化速率数据，并过滤以5-10千赫的低通频率。关于补丁移液器，我们发现，他们并不需要是火抛光，以得到记录，但有趣的是，它似乎提供稍微好一点的机会，取得了良好的密封与糙米移液器相比。由于移液器吸头比较大，我们不加版本Ÿ多正压吸管进入解决方案之前。这需要练习后决定的正压申请成为过剩的压力适量将移动单元格太多，而且可以防止密封形成。它也可能损害突触接触的细胞轻轻地从它的原始位置移动。在另一方面，压力太小会造成脏技巧和不干净的细胞不够好，形成良好的密封表面。一个折中的仅是显著的实践和经验获得。密封的形成可以与负电压，以移液管的应用得到加强。我们通常有1.2-2GΩ的印章，这是极好的突破到全细胞模式。

当药物制剂需要被施加到细胞的细胞质中，我们将它们包括在填充所述吸移管前细胞内的溶液。护理应准备吸管的解决方案时，避免药物的损失采取由具有其绑定到0.22微米的过滤器。因此，我们首先筛选的细胞内介质，然后在药理学试剂仔细添加到过滤后的溶液。化合物在细胞内的隔间应用程序都有自己的一套独特的挑战。举例来说，除了药物对细胞内的介质通常降低形成GΩ封的机会，而不是到这种地步，这是一个重大障碍的实验。

人们应该认识到在这种方式药理剂的应用程序不允许实验者记录的最合适的控制，因为该剂具有从全细胞组态的起始立即进入细胞内。因此，尽管我们在本类型的实验记录数据，人们必须意识到，下一个最好的控制是代理的非活性形式在细胞内的应用。在许多情况下，这需要一个热灭活化合物的形式时，加扰的肽ør是供应商获得一个无效的异构体。

我们获得了在突触电流（MPSCS），电压门控电流和动作电位的表单数据。微型电流可能由几个优秀节目（pClamp，Axograph等）进行分析，虽然我们优选使用Axograph X（约翰克莱门特）。 Axograph X运行于Windows和Macintosh平台上，可用于电生理数据的同时采集和分析。 mEPCs购入用实验者的选择一个模板，从所述记录本身得到的援助。单个事件可以为属性，如上升时间，幅度，半宽度和衰减时间，等我们的数据的电子表格导出为Kaleidagraph科学（协同软件），我们可以生产数字，包括Axograph X的事件跟踪副本进行分析

一个实验的更困难的方面是确定是否执行不够好，以提供清洁的记录，可靠的数据。例如，空间夹紧问题可能记录从M-细胞，具有较大的轴突和树突的广泛过程MPSCS时出现。当电压钳位，可以大致控制电压在移液 ​​管的尖端相当好（特别是如果所述接入电阻（R _a）为低），但可能没有足够的膜电位的适当的控制中树枝状突起或轴突，远远远离枪头。确定所述细胞为正常空间夹紧的一种方法是产生的上升时间的散点图与被记录的MPSCS的振幅。数据之间的相关性是暗示空间夹紧不足。换句话说，如果该空间钳较差然后发生靠近吸管MPSCS将具有更快的上升时间和更大的幅度比存在一段距离的移液管的事件。如果一个相关性不存在，则该数据是有问题的，并且不能被使用。

另一个方面电生理记录，需要加以解决的是，泄漏电流。这一点尤其是当电压钳位，以便记录电压-门控电流的如Na ⁺或K ⁺电流的小区。当膜电位从其余偏离时，泄漏电流可以随着电压 – 门控的​​活动被记录。泄漏电流_（I L），钾_（ⅠK）的组合，钠（I _Na）的氯化物和（I _Cl）的电流通过非电压门控通道将掩盖感兴趣的活性，必须从记录中减去。该放大器能够运行什么通常称为P / N协议的录制过程中在线执行此功能。在一个P / N协议放大器将来自其余运行几个小的去极化（或hyperpolarizations），并会记录发生所产生的漏电流。使用足够小的脉冲不激活电压门控通道是很重要的。当前在这些脉冲中发生s的记录，并取平均值，以便这些泄漏电流可以从电压 – 门控通道活性被减去。

最后，一​​个需要考虑的结电位，其中发生在胞内和胞外溶液之间的电极的尖端。细胞内和细胞外溶液通常由不同的离子，具有不同的活动和迁移率。较大的离子具有较低的迁移率将提供一个较大的电阻率，以离子运动比小，这可能导致在溶液的结的小，但显著电位差。确定所经历的细胞的适当的电压时，此结电位，必须考虑到。

这里介绍的技术是一家长年使用我们的实验室。但是，也有记录的从M-细胞的替代方法。最值得注意的是，约瑟夫Fetcho和他的同事开发编极好的制剂，其中一个可以从旧的幼虫（4-5日龄）的一种微创方式的M-细胞比在此处，M-细胞是从背侧表面¹⁶接触提交记录。我们曾尝试了类似的技术，但发现它更容易从后脑，其中所述细胞是更接近大脑的表面，尤其是在年轻鱼（ 即 24个高倍视野至72 HPF）的腹侧面接近的M-细胞。另外，从背表面上的方法通常需要使用表达荧光标记的M-细胞，其具有引入额外的变量到记录的电势的转基因系的。当使用野生型鱼这个问题不存在。然而，这里介绍的技术，我们只限于研究年轻的动物（24个高倍视野72个高倍视野）。因此，每一种方法都有其优点和局限性。

学生氏t-检验，可用于比较两个组数据而瓦里安的分析CE（ANOVA），可用于比较多个组。必须小心选择合适的事后检验的参数与非参数数据。