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Bioengineering

Filtro de aire dispositivos, incluyendo mallas tejidas de electrospun recombinantes Las proteínas de seda de araña

Published: May 08, 2013
doi:
10.3791/50492
, ,
1Biomaterials Research Group,University of Bayreuth

Summary

Fibras de seda de araña muestran propiedades mecánicas extraordinarias. Diseñado<em> Araneus diadematus</em> Fibroína 4 (eADF4) se puede procesar en mallas no tejidas utilizando electrospinning. Aquí, los eADF4 mallas no tejidas se utilizan para mejorar el rendimiento de los dispositivos de filtrado de aire.

Abstract

Basado en la secuencia natural de Araneus diadematus fibroína 4 (ADF4), la proteína de seda de araña recombinante eADF4 (C16) ha sido diseñado. Esta proteína altamente repetitiva tiene un peso molecular de 48kDa y es soluble en disolventes diferentes (hexafluoroisopropanol (HFIP), ácido fórmico y tampones acuosos). eADF4 (C16) proporciona un alto potencial para diversas aplicaciones técnicas cuando se procesa en morfologías tales como películas, cápsulas, partículas, hidrogeles, recubrimientos, fibras y mallas no tejidas. Debido a su estabilidad química y morfología controlada, el último puede ser utilizado para mejorar los materiales de filtro. En este protocolo, se presenta un procedimiento para aumentar la eficiencia de los diferentes dispositivos de filtro de aire, por la deposición de mallas no tejidas de proteínas de seda de araña recombinantes electrospun. Electrospinning de eADF4 (C16) disuelto en los resultados de HFIP en fibras suaves. Variación de la concentración de proteína (5-25% w / v) en los resultados de diferentes diámetros de las fibras (80-1,100 nm) ypor lo tanto, tamaños de poro de la malla no tejida.

Post-tratamiento de eADF4 (C16) electrospun de HFIP es necesario ya que la proteína muestra una estructura predominantemente α-helicoidal secundaria en fibras recién hiladas, y por lo tanto las fibras son solubles en agua. El tratamiento posterior con vapor de etanol induce la formación de resistente al agua, estructuras β-hoja estables, la preservación de la morfología de las fibras de seda y mallas. Análisis de la estructura secundaria se realizó mediante espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) y la posterior de Fourier auto-deconvolución (FSD).

El objetivo principal era mejorar la eficiencia del filtro de sustratos filtrantes existentes mediante la adición de capas no tejidos de seda en la parte superior. Para evaluar la influencia de electrospinning duración y por lo tanto espesor de la capa no tejida sobre la eficiencia del filtro, se realizó pruebas de permeabilidad al aire en combinación con mediciones de la deposición de partículas. Los experimentos se llevaron a cabo según la normaprotocolos.

Introduction

Debido a su combinación de fuerza y extensibilidad, fibras de seda de araña pueden absorber más energía cinética que la mayoría de otras fibras naturales o sintéticas 1. Además, a diferencia de la mayoría de los materiales poliméricos sintéticos materiales de seda no son tóxicos y biocompatibles y causan ninguna reacción alérgica cuando se incorporan 2,3. Riesgos para la salud putativos se pueden prevenir mediante el uso de la seda de araña. Estas características hacen de la seda de araña altamente atractivo para una variedad de aplicaciones médicas y técnicas. Dado que las arañas no pueden ser cultivadas debido a su comportamiento caníbal, métodos biotecnológicos han sido desarrollados para producir proteínas de seda de araña, tanto de manera rentable y en cantidades suficientes 4.

La proteína de seda recombinante eADF4 (C16) ha sido diseñada sobre la base de la secuencia natural de Araneus diadematus fibroína 4 (ADF4). eADF4 (C16) tiene un peso molecular de 48kDa 5 y es soluble en diversos disolventes (hexafluoroisopropanol (HFIP) 6, ácido fórmico 7 y tampones acuosos) 8. eADF4 (C16) se puede procesar en diferentes morfologías tales como películas 9, cápsulas de 8, las partículas 10, 11 hidrogeles, revestimientos 7, fibras y mallas no tejidas 12 6. Debido a su estabilidad química, este último proporciona un alto potencial en aplicaciones de filtro.

A continuación, se presenta un protocolo para la fabricación de dispositivos de filtro de aire, incluyendo una malla tejida de proteínas de seda de araña recombinante electrospun. Hilado electrospinning o electrostática es una técnica empleada típicamente para la producción de fibras de polímero con diámetros en el intervalo de 10 nm -10 13 micras, y mallas no tejidas ya han sido investigados para aplicaciones de filtro 14. En el pasado, electrospinning se ha aplicado con éxito para el procesamiento de regenerado 15, así como 16 producida de forma recombinante la seda de arañaproteínas. Normalmente, una tensión eléctrica de alta (5-30 kV) se aplica a una jeringa y un contraelectrodo (0-20 kV) colocado en una distancia de 8-20 cm. El fuerte campo electrostático induce fuerzas de repulsión en la solución cargada. Si se supera la tensión superficial, se forma un cono de Taylor, y un fino chorro entra en erupción de la punta 17,18. Después de la formación, se producen inestabilidades de flexión dentro del chorro causando un mayor estiramiento como se evapora el disolvente, y se forma una fibra sólida. Por último, la fibra se deposita al azar sobre el electrodo contador como una malla no tejida 19. Propiedades de la fibra como la topología de diámetro y la superficie (lisa, porosa) son principalmente dependientes de parámetros de la solución tales como la concentración, la viscosidad, la energía libre superficial y la conductividad eléctrica intrínseca del disolvente y la permeabilidad 20. Electrospinning de eADF4 (C16) disuelto en los resultados de HFIP en fibras lisas con diámetros de 80-1,100 nm en función de la concentración de proteínas en la solución.eADF4 (C16) electrospun de HFIP muestra una estructura predominantemente α-helicoidal secundaria y las fibras son solubles en agua 6. Con el fin de estabilizar las fibras de seda, las estructuras de β-hoja tienen que ser inducida por el tratamiento posterior con etanol. En contraste con los métodos previamente establecidos después del tratamiento 21, en ​​este estudio eADF4 (C16) no tejidos han sido tratados con vapor de etanol con el fin de preservar la morfología de las fibras de seda. Análisis de la estructura secundaria se realizó mediante espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) y la posterior de Fourier auto-deconvolución (FSD) como se describe en la literatura 22. FSD es una herramienta de procesamiento de señal que permite la resolución de los espectros de FTIR que consiste en varias bandas superpuestas. De este modo, las bandas indistintas de la amplia en medio de I región puede ser reducido usando un filtro de paso alto para recibir un espectro desconvolucionado con la mejora de resoluciones pico.

Con el fin de evaluar la eficiency de sustratos de filtro complementados con mallas no tejidas de seda, pruebas de permeabilidad al aire se llevaron a cabo utilizando un dispositivo de Akustron de acuerdo con protocolos estándar. Los índices de depósito se midieron usando un medidor de partículas universales Palas.

Protocol

1. Spinning Preparación Dope Tome liofilizado eADF4 (C16) de proteínas. Pesar 20 mg de eADF4 (C16) en un recipiente de reacción de 1 ml mediante el uso de una escala de alta precisión. Añadir 200 l de hexafluoroisopropanol (HFIP) y sellar el recipiente con Parafilm. Nota: HFIP es altamente volátil y perjudicial. Ya que puede causar daños en el sistema respiratorio, el trabajo bajo una campana de seguridad, la pipeta con cuidado, y tape el tubo. Agite la suspensión durante 1 min y más sacudirlo para eliminar la solución. Para asegurarse de que la cantidad total de proteína se haya disuelto completamente, espera durante la noche. 2. Electrospinning Preparar el dispositivo de electrospinning (Figura 1): lugar del material de filtro en la parte superior de la contra-electrodo y preestablecer el voltaje de tanto el electrodo (-22,5 kV) y el contraelectrodo (2,5 kV). Ajuste el caudal de 315 l / h. Nota: while electrospinning, HFIP tóxicos se evaporó. Asegúrese de que su dispositivo electrohilado está conectada a una campana de humos. Tome una aguja 20 G disponible en el mercado y moler la punta afilada con un molino de mano a una longitud residual de 30 mm. Conectar la aguja a una jeringa de 1 ml. Nota: Una punta de la aguja plano se requiere con el fin de generar un cono de Taylor bien definido. Cargar toda la solución de hilado (200 l) en la jeringa. Superposición de la droga con 100 l de aire, con el fin de permitir que la solución completa a ser extruido durante el proceso de hilado. Nota: A fin de evitar la obstrucción de la aguja, asegúrese de que no hay partículas (agregados o impurezas) en la solución de hilatura. Trabajar bajo una campana de humos! Coloque la jeringa llena a la bomba de jeringa del dispositivo de electrospinning y presiona cuidadosamente el pistón en la jeringa hasta que aparece una gota en la punta de la aguja. Bloquear el pistón. Establezca la distanciaentre la punta de la aguja y el contraelectrodo a 8-20 cm. Arrancar la bomba de jeringa y retire la gotita (por lo general seca) de la abertura de la aguja. Activar todas las instalaciones de seguridad del dispositivo de electrospinning inmediatamente y empezar la fuente de alto voltaje, tan pronto como aparece una nueva gota. Electrospinning de la solución de hilado se iniciará posteriormente. Use un cronómetro para controlar el tiempo de hilatura. Nota: Con el fin de evitar la desecación de la solución y por lo tanto la obstrucción de la aguja, es necesario iniciar inmediatamente el proceso de hilatura después de la eliminación de la gotita seca. Desde electrospinning de proteínas de seda de araña recombinantes depende de la humedad y de la temperatura, una adaptación de los parámetros del proceso hacia condiciones de laboratorio individuales podría ser necesario (Figura 2). Nota: Para evitar que la gotita de secado (Figura 2B) permitir a una velocidad de flujo suficiente. Si hay una baja humidiTy en la atmósfera circundante, ajustar la humedad relativa o elevar la velocidad de flujo. Bajar el voltaje hasta que se produce un cono de Taylor adecuada (Figura 2A). Cuando no existe una solución en la punta (Figura 2C), aumentar la tasa de flujo y bajar el voltaje hasta que se produce una gotita. A continuación, ajustar el voltaje con el fin de establecer un cono de Taylor regular y estable (Figura 2A). Después de 30 seg / 60 seg / 90 seg del interruptor de la bomba de jeringa electrohilado. Con el fin de evitar la caída de las gotitas, espere 10 segundos antes de apagar la fuente de alta tensión para liberar la presión residual en la jeringa. Pasos 6 a 8 se pueden realizar en diferentes tipos de materiales de filtro, tales como poliamida, polipropileno y mallas no tejidas de poliéster, así como papel negro para la comparación. Para producir una malla tejida para experimentos de estabilidad posteriores, utilice papel negro en lugar del material de filtro y realice los pasos 5 a 7. Después de 5 min de electrospinning, deje deel proceso como se describe en el paso 8. 3. Post-tratamiento de mallas tejidas de seda Precalentar el horno a 60 ° C. Coloque los soportes de filtro con eADF4 (C16) mallas tejidas vertical y con una distancia mínima de 2 cm en un recipiente con cierre de vidrio. El recipiente debe tener dos aberturas que se utilizarán para introducir posteriormente etanol y agua. Nota: Al fijar los materiales de filtro, asegúrese de que la superficie necesaria para los experimentos de permeabilidad no es dañado por las abrazaderas. Conecte dos jeringas 60 ml, uno lleno de etanol y una con agua, con tubos de silicona que apuntan hacia la parte inferior interior del recipiente de post-tratamiento (Figura 3). Nota: Con el fin de ser capaz de eliminar el líquido del recipiente después del tratamiento, colocar las aberturas de los tubos lo más cerca posible a la parte inferior. Coloque el recipiente de post-tratamiento en el oven y añadir 60 ml de etanol mediante la extrusión de la jeringa. Use un cronómetro para controlar el tiempo de tratamiento. Después de 90 min de tratamiento con vapor de etanol, eliminar el etanol con la jeringa desde el cristal, y añadir 60 ml de agua de la segunda jeringa. Espere otros 90 minutos, luego retire el agua y apagar el horno. Con el fin de evitar las gotas por condensación, deje el recipiente en el horno hasta que se haya enfriado completamente. 4. Análisis de la seda de araña tejidas mallas Preparar las mallas tejidas de seda para las pruebas de estabilidad en el papel negro o cualquier otro soporte extraíble. Corte dos marcos de cartón y ajustar la cinta adhesiva de doble pegajosa. Pulse un cuadro sobre la malla tejida seda depositada en papel negro y el uso de un bisturí para cortar el exceso de fibras de seda (mantener las fibras en exceso para su posterior SEM-imagen). Retire con cuidado el marco con el fin de separar el tejido del papel. Repita este paso con el segundo marco(Figura 4). Práctica de pruebas de inmersión: Cortar una pieza (1 cm 2) de cada uno, la seda de malla tejida post-tratada y la no tratada y la inmersión en agua desionizada. El no tratado de malla no tejida de seda se disuelve inmediatamente, mientras que la malla no tejida tratada será estable (Figura 5). Después de la inmersión, secar la muestra sumergida y prepararlo para SEM de imágenes. Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR)-medición y posterior de Fourier auto-deconvolución (FSD): Con el fin de obtener información sobre los cambios estructurales de las proteínas de la seda sobre post-tratamiento de las mallas no tejidas, FTIR se puede aplicar usando los parámetros: Transmitancia -mode, escaneo de 800 a 4000 cm -1, 60 acumulaciones se mide y se promedia para cada espectro, una referencia se mide por espectro. Para el análisis cuantitativo de los datos, FSD se puede emplear (Figura 6 y Figura 7). De este modo, las curvas se reducen a la AR datosea entre 1590 y 1705 cm -1 y una corrección de línea de base se lleva a cabo. Un ajuste de mínimos cuadrados local se calcula de acuerdo a las posiciones de los picos tomados de estudios anteriores (1611, 1619, 1624, 1630, 1640, 1650, 1659, 1666, 1680, 1691, 1698 cm -1) 22. Imágenes SEM: SEM se puede aplicar a investigar diámetros de las fibras y de la morfología de las fibras de seda en diferentes sustratos de filtro y para analizar la influencia de la post-tratamiento en la morfología de la fibra (Figura 8). Utilice aumentos de 5.000 x 25.000 x con el fin de obtener imágenes suficientemente detalladas. 5. Determinación de la permeabilidad al aire Coloque una pieza de fijación adecuada del material de filtro en la zona de un dispositivo de medición de la permeabilidad del aire Akustron. Nota :: Si utiliza otro tipo de dispositivo de permeabilidad al aire, asegúrese de que cumple los requisitos de la norma DIN 53 887, DIN 53 120, ISO 9237 y las normas ASTM D 737-96. Emplear un dispositivo de permeabilidad al aire Akustron (o cualquier otra tal como se representa en 5.1). Si es necesario calcular los datos normados [l / (m 2 x seg)]. Repita los pasos 1 y 2, al menos 10 veces con diferentes partes de la muestra y calcular la media aritmética (Figura 9). Nota: permeabilidad al aire de medición requiere contacto del dispositivo y la malla no tejida. Por lo tanto, un manejo cuidadoso de las muestras es esencial para evitar la ruptura de la delicada seda de malla no tejida. 6. Determinación de la Eficacia del filtro Utilice una máquina adecuada con el control de la presión y contador de partículas, tales como un medidor de partículas universal (Palas GmbH, Karlsruhe, Alemania). Colocar las muestras de filtro en el dispositivo de retención de partículas y medida (Figura 10). Aerosol: Di-etil-hexil-sebacat (DEHS), tamaño de las partículas: 0,3 a 3 micras, duración: 30 segundos, velocidad del líquido: 2350 cm / seg; flujo de aire: 3.400 m 3 / hr. <br/> Nota: Maneje la muestra con cuidado y no toque la superficie para evitar la destrucción de la malla tejida y evitar cualquier contaminación. Asegúrese de crear suficientes muestras de igual calidad para las mediciones de rendimiento.

Representative Results

Electrospinning de soluciones de seda de araña recombinantes con concentraciones de 10% w / v desde HFIP dio como resultado en las fibras lisas con diámetros que van de 80 a 120 nm, lo que permite la formación de mallas no tejidas. Post-tratamiento con vapor de etanol no dio lugar a cambios morfológicos visibles, que era, por lo tanto, estableció como una forma adecuada de seda tejido post-tratamiento (Figura 8). No se detectaron cambios estructurales utilizando FT-IR y la posterior FSD de medio de bandas que se realizó para analizar la contribución picos individuales (Figura 6). Se pudo demostrar que el post-tratamiento conduce a un aumento en las estructuras de β-hoja, mientras que el contenido de α-helicoidal estructuras de bobina al azar und disminuye (Figura 7). Este resultado puede ser prácticamente probado por inmersión de un post-tratado no tejida en agua (Figura 5). Incluso después de una semana, no se producirá la disolución de la malla no tejida. El hilado duración es el parámetro más importante relativa a la aplicación de tejidos de seda en materiales de filtración debido a la pérdida de carga basado en el aumento de la densidad de las fibras electrospun. Extendido hilado duraciones und por lo tanto un mayor número de capas de fibra de resultado en una disminución exponencial de la permeabilidad al aire. Este efecto puede ser detectado para todos los diferentes materiales de sustrato de filtro antes y después del post-tratamiento (Figura 9). Del mismo modo, la eficacia de filtrado de los materiales de filtro de seda que contienen de las partículas sub-micrométricas aumenta (Figura 10). Mientras duraciones hilado cortos (30 segundos) obtienen bajas eficiencias de filtración, mayor duración de hilatura (90 sec) conducen a una mayor eficiencia. Figura 1. Tensión eléctrica de alta (0-30 kV) i s aplicó a una jeringa llena con una solución de seda, y un contraelectrodo (0-20 kV) se coloca en una distancia de 8-20 cm. Esta configuración conduce a un fuerte campo electrostático, la inducción de fuerzas de repulsión dentro de la solución cargada. Si se supera la tensión superficial, se forma un cono de Taylor, y un fino chorro entra en erupción de la punta. Después de la formación, se producen inestabilidades de flexión dentro del chorro causando un mayor estiramiento como se evapora el disolvente, y se forma una fibra sólida. Por último, la fibra se deposita al azar sobre el electrodo contador en la forma de una malla no tejida. Figura 2. Fotografías de un cono de Taylor normal (A), una gotita seca (B), y la configuración sin gotita (C). iles/ftp_upload/50492/50492fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50492/50492fig3.jpg "/> Figura 3. Esquema durante el procedimiento de vapor de post-tratamiento. En el primer paso, la cámara se llena con etanol, y la muestra se cuece al vapor a 60 ° C durante 90 min. Con el fin de suavizar las mallas tejidas para la posterior manipulación, el etanol se elimina y las fibras se cuece al vapor con vapor de agua durante 90 minutos a 60 ° C. Haga clic aquí para ver más grande la figura . Figura 4. Fotografía de un marco de cartón con adjuntos mallas tejidas de seda que se utilizarán para el tratamiento posterior. Figura 5. Electrosplas Naciones Unidas y, posteriormente, post-tratado no tejidos en estado seco (A) y bajo el agua (B). Figura 6. Fourier espectro de absorbancia de auto-deconvolucionados de una banda de amida I de un sin tratar (A) y un post-tratado (B) la seda de araña no tejido de malla. La línea continua muestra la banda de absorbancia resultante de los picos de contribución única (líneas de puntos) como se deriva después de deconvolución. La asignación de las respectivas curvas se basa en los valores publicados previamente en la literatura 22. Haga clic aquí para ver más grande la figura . <img alt="La figura 7" fo:conten t-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50492/50492fig7highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50492/50492fig7.jpg" /> Figura 7. Estructura secundaria contenido de mallas tejidas, no tratados, y post-tratado eADF4 (C16). . Figura 8 imágenes de SEM de electrospun eADF4 (C16)-fibras en diferentes sustratos filtro: Poliamida (PA), fibras de poliéster (PE), polipropileno (PP) y eADF4 puro (C16) antes de (S1) y después (S2) post- tratamiento con vapor de etanol. Haz clic aquí para ver más grande la figura . / Ftp_upload/50492/50492fig9.jpg "/> Figura 9. Pruebas de permeabilidad al aire, antes (A) y después del post-tratamiento (B) de las mallas de seda no tejidas con vapor de etanol, aumentando los tiempos de hilado conducen a capas más no tejidos posteriormente bajar la permeabilidad al aire. Figura 10. La eficacia del filtro de aerosol de di-etil-hexil-sebacat en electrospun seda de araña mallas no tejidas en materiales de filtro de poliamida en diferentes duraciones de hilatura, que influyen en la cantidad de capa de seda, después del post-tratamiento con etanol.

Discussion

Nuevos dispositivos de filtro deben permitir reducir el consumo total de energía en la filtración de aire en la eficiencia del filtro constantes o superior. En este caso, estos dispositivos fueron creados usando materiales no tejidos hechos de la seda de araña. Debido a su baja tensión superficial y alta volatilidad, HFIP ha sido elegido como un disolvente adecuado para el proceso de electrohilado. Además, las soluciones acuosas de seda se han probado en los experimentos anteriores, pero no hay fibras podrían ser generado. Aquí, sería crucial para el uso de aditivos con el fin de disminuir la tensión superficial y de ese modo mejorar las propiedades de hilado de la solución. El paso más crítico es para ajustar las condiciones y la concentración de material utilizado y el disolvente de la solución de hilado, hilado de altura, la tensión y la velocidad de extrusión. Durante el funcionamiento, por ejemplo, la obstrucción de la punta se puede prevenir mediante el suministro de la punta de la aguja con la humedad en forma de vapor de agua, pero ningún tipo de adiciones en la configuración electrohilado podría posteriormente perturbarel proceso sensible y el campo eléctrico. Parámetros del proceso esenciales (concentración, voltaje, distancia, humedad) se determinaron individualmente llevar a cabo series de experimentos por separado (datos no mostrados). Teniendo en cuenta todos los parámetros es fundamental para cuidar de un cono taylor continuo y proceso de hilado para crear fibras uniformes.

La eficacia del filtro es uno de los parámetros más importantes de los materiales de filtro. Este parámetro está influenciado principalmente por la estructura del material de filtro. Wovens heredan tamaños de poro uniformes y permeabilidad al aire posteriormente consistente. Es crucial para crear mallas tejidas homogéneos en estos materiales de la plantilla para rellenar los poros y generar un filtro de cero defectos. La eficiencia del filtro en nuestros filtros muestra una dependencia directa de la duración de hilado (de las proteínas de seda), y, por lo tanto, en el número de capas de malla no tejidas. Los huecos entre las fibras individuales se llenan constantemente, lo que permite la retención of partículas más pequeñas.

En este trabajo presentamos un método para producir un material de filtro novela con la seda de araña mallas tejidas, por una alta eficiencia del filtro. Por lo tanto, estos filtros son candidatos prometedores para el uso futuro de los sistemas de filtración de aire.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos el apoyo técnico y científico de Anja Lauterbach (Lehrstuhl Biomaterialien), Lorenz Summa (Sandler AG) y Armin Boeck (B / S / H / G). SEM de imágenes fue realizado por Johannes Diehl (Lehrstuhl Biomaterialien). La financiación se deriva de BMBF (01RB0710).

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Lang, G., Jokisch, S., Scheibel, T. Air Filter Devices Including Nonwoven Meshes of Electrospun Recombinant Spider Silk Proteins. J. Vis. Exp. (75), e50492, doi:10.3791/50492 (2013).
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