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Bioengineering

Filtro aria dispositivi tra cui maglie non tessuti di elettrofilate ricombinanti Spider Proteine ​​della Seta

Published: May 08, 2013
doi:
10.3791/50492
, ,
1Biomaterials Research Group,University of Bayreuth

Summary

Fibre di seta di ragno mostrano straordinarie proprietà meccaniche. Engineered<em> Araneus diadematus</em> Fibroina 4 (eADF4) può essere trasformato in mesh non tessuti utilizzando electrospinning. Qui, i eADF4 maglie non tessuti sono utilizzati per migliorare le prestazioni dei dispositivi di filtraggio dell'aria.

Abstract

Basato sulla sequenza naturale di Araneus diadematus fibroina 4 (ADF4), la proteina ricombinante ragno di seta eADF4 (C16) è stato ingegnerizzato. Questa proteina altamente ripetitivo ha un peso molecolare di 48kDa ed è solubile in solventi diversi (esafluoroisopropanolo (HFIP), acido formico e tamponi acquosi). eADF4 (C16) offre un elevato potenziale per varie applicazioni tecniche quando trasformato in morfologie come film, capsule, particelle, idrogel, rivestimenti, fibre e mesh non tessuti. Grazie alla loro stabilità chimica e morfologia controllata, quest'ultima può essere utilizzata per migliorare i materiali filtranti. In questo protocollo, vi presentiamo una procedura per aumentare l'efficienza dei diversi dispositivi di filtraggio dell'aria, dalla deposizione di maglie non tessuti di proteine ​​della seta di ragno ricombinanti elettrofilati. Electrospinning di eADF4 (C16) disciolto in risultati HFIP in fibre lisce. Variazione della concentrazione proteica (5-25% w / v) risultati in diversi diametri delle fibre (80-1,100 nm) equindi dimensioni dei pori della maglia non tessuto.

Post-trattamento di eADF4 (C16) electrospun da HFIP è necessaria poiché la proteina visualizza una struttura predominantemente α-elica secondaria in fibre filate di fresco, e quindi le fibre sono solubili in acqua. Successivo trattamento con vapore di etanolo induce la formazione di resistente all'acqua, strutture β-sheet stabili, conservando la morfologia delle fibre di seta e maglie. Analisi della struttura secondaria è stata effettuata utilizzando la trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa (FTIR) e la successiva Fourier auto-deconvoluzione (FSD).

L'obiettivo primario è stato quello di migliorare l'efficienza del filtro di substrati filtro esistente con l'aggiunta di strati di tessuto non tessuto di seta sulla parte superiore. Per valutare l'influenza della durata electrospinning e spessore di strato così nontessuto sull'efficienza filtro, abbiamo eseguito prove di permeabilità dell'aria in combinazione con misure di deposizione di particelle. Gli esperimenti sono stati condotti secondo la normaprotocolli.

Introduction

Grazie alla loro combinazione di forza ed estensibilità, fibre di seta di ragno in grado di assorbire più energia cinetica della maggior parte delle altre fibre naturali o sintetiche 1. Inoltre, a differenza dei materiali polimerici più sintetici materiali di seta sono atossici e biocompatibili e non causano reazioni allergiche quando incorporato 2,3. Rischi per la salute putativi possono essere evitati utilizzando seta di ragno. Queste caratteristiche fanno di seta di ragno molto attraente per una varietà di applicazioni mediche e tecniche. Dal momento che i ragni non possono essere coltivati ​​a causa del loro comportamento cannibale, metodi biotecnologici sono stati sviluppati per la produzione di proteine ​​della seta di ragno, sia a costi contenuti e in quantità sufficienti 4.

La proteina ricombinante seta eADF4 (C16) è stato ingegnerizzato in base alla sequenza naturale di Araneus diadematus fibroina 4 (ADF4). eADF4 (C16) ha un peso molecolare di 48kDa 5 ed è solubile in vari solventi (hexafluoroisopropanol (HFIP) 6, acido formico 7 e tamponi acquosi) 8. eADF4 (C16) può essere trasformato in diverse morfologie come film 9, capsule 8, particelle 10, idrogel 11, 7 rivestimenti, fibre 12 e le maglie non tessuto 6. Grazie alla loro stabilità chimica, che forniscono a elevato potenziale in applicazioni del filtro.

Qui vi presentiamo un protocollo per fabbricare dispositivi di filtraggio dell'aria, in particolare una maglia non tessuto di proteine ​​della seta di ragno ricombinanti elettrofilati. Filatura Electrospinning o elettrostatici è una tecnica tipicamente impiegata per produrre fibre di polimeri con diametri nell'intervallo di 10 nm -10 micron 13, e maglie non tessuti sono già stati studiati per applicazioni del filtro 14. In passato, electrospinning è stato applicato con successo per l'elaborazione dei rigenerata 15, nonché ricombinante prodotta 16 seta di ragnoproteine. Tipicamente una tensione elettrica elevata (5-30 kV) è applicato ad una siringa e un controelettrodo (0-20 kV) immessi in una distanza di 8-20 cm. Il forte campo elettrostatico induce forze repulsive all'interno della soluzione carica. Se la tensione superficiale viene superato, un cono Taylor si forma, e un getto sottile scoppia dalla punta 17,18. Dopo la formazione, le instabilità di flessione si verificano all'interno del getto causando ulteriore allungamento come il solvente evapora, e una fibra solida è formata. Infine, la fibra viene depositato in modo casuale sulla controelettrodo come mesh non tessuto 19. Proprietà di fibre come topologia diametro e superficie (liscia, porosa) sono prevalentemente a carico dei parametri di soluzione come la concentrazione, la viscosità, energia libera di superficie e intrinseca conducibilità elettrica del solvente e la permeabilità 20. Electrospinning di eADF4 (C16) disciolto in HFIP risultati in fibre lisce con diametri da 80-1,100 nm a seconda della concentrazione proteica nella soluzione.eADF4 (C16) electrospun da HFIP visualizza una struttura predominantemente α-elica secondaria e le fibre sono solubili in acqua 6. Al fine di stabilizzare le fibre di seta, strutture β-foglio dovrà essere indotta dal successivo trattamento con etanolo. In contrasto con i metodi precedentemente stabiliti post-trattamento 21, in questo studio eADF4 (C16) non tessuti sono stati trattati con vapori di etanolo al fine di preservare la morfologia delle fibre di seta. Analisi della struttura secondaria è stata eseguita usando spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FTIR) e successiva Fourier auto-deconvoluzione (FSD) come descritto in letteratura 22. FSD è uno strumento di elaborazione del segnale che permette di risoluzione spettri FTIR costituito da più bande sovrapposte. In tal modo, le fasce indistinte del largo in mezzo io regione può essere ridotto utilizzando un filtro passa alto per ricevere uno spettro deconvoluto con migliori risoluzioni di punta.

Al fine di valutare l'efficiency di substrati filtranti integrate con le maglie non tessuto di seta, prove di permeabilità all'aria sono stati eseguiti utilizzando un dispositivo Akustron secondo protocolli standard. I tassi di deposizione sono stati misurati utilizzando un Palas Particle Sizer universale.

Protocol

1. Spinning Dope Preparazione Prendere liofilizzato eADF4 (C16) di proteine. Pesare 20 mg di eADF4 (C16) in un recipiente 1 ml di reazione utilizzando una bilancia ad alta precisione. Aggiungere 200 ml di esafluoroisopropanolo (HFIP) e sigillare il vaso con parafilm. Nota: HFIP è altamente volatile e deleteria. In quanto può causare danni alla pista respiratorio, lavorare sotto una cappa di sicurezza, pipetta con attenzione, e tappare il tubo. Vortex la sospensione per 1 min e agitare ulteriormente per eliminare la soluzione. Per garantire che l'intera quantità di proteine ​​è completamente sciolto, attendere durante la notte. 2. Electrospinning Preparare il dispositivo electrospinning (Figura 1): il materiale filtrante posto in cima al controelettrodo e preimpostare la tensione sia l'elettrodo (-22.5 kV) e il contro elettrodo (+2,5 kV). Impostare la portata in volume a 315 ml / h. Nota: wentre electrospinning, HFIP tossico sarà evaporato. Assicurati che il tuo dispositivo electrospinning è collegato ad una cappa aspirante. Prendere un commercialmente disponibile ago da 20 G e macinare la punta affilata con una smerigliatrice mano per una lunghezza residua di 30 mm. Collegare l'ago a una siringa da 1 ml. Nota: Una punta dell'ago aereo è necessaria al fine di generare un cono Taylor ben definita. Caricare l'intero droga filatura (200 pl) nella siringa. Sovrapporre la droga con 100 microlitri di aria, al fine di consentire la soluzione completa da estrudere durante il processo di filatura. Nota: Per evitare l'ostruzione dell'ago, assicurarsi che non vi siano particelle o impurità (aggregati) nella droga filatura. Lavorare sotto cappa aspirante! Attaccare la siringa riempita alla pompa siringa del dispositivo electrospinning e premere con cautela il pistone sulla siringa finché una goccia appare sulla punta dell'ago. Bloccare il pistone. Impostare la distanzatra la punta dell'ago e il controelettrodo di 8-20 cm. Avviare la pompa a siringa e rimuovere il (solito asciugato) gocciolina dall'apertura dell'ago. Attivare tutti gli impianti di sicurezza del dispositivo electrospinning immediatamente e iniziare la sorgente ad alta tensione, non appena compare una nuova goccia. Electrospinning della droga filatura inizierà successivamente. Utilizzare un cronometro per controllare la durata di filatura. Nota: Per evitare l'essiccazione della soluzione e quindi intasamento dell'ago, è necessario avviare immediatamente il processo di filatura dopo aver rimosso la gocciolina essiccata. Poiché electrospinning di proteine ​​della seta ricombinanti ragno dipende umidità e temperatura, un adattamento dei parametri di processo verso condizioni di laboratorio individuali potrebbe essere necessario (Figura 2). Nota: per evitare il droplet da essiccazione (Figura 2B) consentire una portata sufficiente. Se c'è un umidificazione bassaty nell'atmosfera circostante, regolare l'umidità relativa o aumentare la portata. Abbassare la tensione finché non si verifica una corretta cono Taylor (Figura 2A). Quando non vi è alcuna soluzione sulla punta (Figura 2C), sollevare la portata e abbassare la tensione finché si verifica una gocciolina. Quindi regolare tensione al fine di stabilire un regolare e stabile Taylor Cone (Figura 2A). Dopo 30 sec / 60 sec / 90 sec di spegnere la pompa siringa electrospinning. Al fine di evitare le goccioline che cadono, attendere 10 secondi prima di spegnere l'alta fonte di tensione per rilasciare la pressione residua nella siringa. Passaggi 6 a 8 possono essere eseguite su diversi tipi di materiali filtranti, quali poliammide, polipropilene e tessuto non tessuto di poliestere mesh, nonché carta nera per il confronto. Per produrre una mesh non tessuto per esperimenti stabilità successive, utilizzare carta nero invece del materiale filtrante ed effettuare i passaggi da 5 a 7. Dopo 5 min di electrospinning, stopil procedimento come descritto nel passaggio 8. 3. Post-trattamento di seta maglie non tessuti Pre-riscaldare un forno a 60 ° C. Posizionare i supporti filtranti con eADF4 (C16) le maglie non tessuto in verticale e con una distanza minima di 2 cm in un contenitore di vetro chiuso a chiave. Il contenitore deve avere due aperture che saranno utilizzati per introdurre successivamente etanolo ed acqua. Nota: Nel fissare i materiali filtranti, assicurarsi che l'area necessaria per esperimenti di permeabilità non sia danneggiata dalle pinze. Collegare due 60 ml siringhe, uno pieno di etanolo e una con acqua, con tubi silicone puntano sul fondo interno del contenitore di post-trattamento (Figura 3). Nota: Per essere in grado di rimuovere il liquido dal contenitore dopo il trattamento, posizionare le aperture dei tubi il più vicino possibile al fondo. Posizionare il contenitore di post-trattamento nel ovit e aggiungere 60 ml di etanolo estrudendo la siringa. Utilizzare un cronometro per controllare la durata del trattamento. Dopo 90 min di etanolo trattamento dei vapori, rimuovere l'etanolo con la siringa dal vetro, e aggiungere 60 ml di acqua dalla seconda siringa. Attendere altri 90 minuti, quindi rimuovere l'acqua e spegnere il forno. Per evitare goccioline di condensa, lasciare il contenitore nel forno finché non è completamente raffreddato. 4. Analisi di seta di ragno non tessuto mesh Preparare le maglie non tessuti di seta per le prove di stabilità su carta nera o qualsiasi altro supporto rimovibile. Tagliate due cornici di cartone e regolare nastro bi-adesivo. Premere un fotogramma nel mesh non tessuto di seta depositato sulla carta nera e utilizzare un bisturi per tagliare l'eccesso di fibre di seta (mantenere le fibre in eccesso per la successiva SEM-Imaging). Rimuovere attentamente il telaio per staccare il tessuto dalla carta. Ripetere questa operazione con il secondo telaio(Figura 4). Prova di tuffo pratiche: Tagliare un pezzo (1 cm 2) di ciascuno, la seta della maglia non tessuto post-trattati e non trattati e immergerlo in acqua deionizzata. La seta maglia non tessuto non trattato immediatamente sciogliere, mentre la maglia non tessuto trattata sarà stabile (figura 5). Dopo l'immersione, essiccare il campione immerso e prepararlo per la SEM imaging. Trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa (FTIR), la misurazione e la successiva Fourier auto-deconvoluzione (FSD): Al fine di ottenere informazioni circa i cambiamenti strutturali delle proteine ​​della seta su di post-trattamento delle maglie non tessuti, FTIR può essere applicato utilizzando i parametri: Trasmittanza -modalità di scansione da 800 a 4000 cm -1, 60 accumuli sono misurati e la media per ogni spettro, un riferimento è misurato per ogni spettro. Per l'analisi quantitativa dei dati, FSD può essere impiegato (figure 6 e 7). In tal modo, le curve sono ridotte al dati arEA tra 1.590 e 1.705 centimetri -1 e una correzione di base viene eseguita. Dei minimi quadrati locale viene calcolato in base alle posizioni di punta tratti da studi precedenti (1611, 1619, 1624, 1630, 1640, 1650, 1659, 1666, 1680, 1691, 1698 centimetri -1) 22. SEM Imaging: SEM può essere applicato per indagare diametri delle fibre e la morfologia delle fibre di seta su diversi substrati filtranti e di analizzare l'influenza del post-trattamento sulla morfologia delle fibre (Figura 8). Utilizzare ingrandimenti di 5.000 x a 25.000 x al fine di ottenere immagini sufficientemente dettagliate. 5. Determinazione della permeabilità all'aria Collocare un adeguato raccordo parte del materiale filtrante sull'area di misurazione di un dispositivo di permeabilità all'aria Akustron. Note :: Se si utilizza un altro tipo di dispositivo di permeabilità all'aria, assicurarsi che soddisfi i requisiti della norma DIN 53 887, DIN 53 120, ISO 9237 e ASTM D 737-96 standard. Utilizzare un dispositivo di permeabilità all'aria Akustron (o di qualsiasi altro, come raffigurato in 5.1). Se necessario calcolare i dati normati [l / (m 2 x sec)]. Ripetere i passaggi 1 e 2, almeno 10 volte con diverse parti del tuo campione e calcolare la media aritmetica (Figura 9). Nota: Misurazione permeabilità all'aria richiede il contatto del dispositivo e la maglia non tessuto. Così, un'attenta gestione dei campioni è essenziale per impedire la rottura del delicato seta maglia tessuta. 6. Determinazione del filtro Efficienza Utilizzare una macchina con adeguato controllo della pressione e contatore di particelle, come una particella sizer universale (Palas GmbH, Karlsruhe, Germania). Porre i campioni del filtro nel dispositivo di misura e di ritenzione di particelle (Figura 10). Aerosol: Di-etil-esil-sebacat (DEHS); dimensioni delle particelle: 0,3-3 micron; durata: 30 sec; velocità del liquido: 2,350 cm / sec; Portata aria: 3.400 m 3 / h. <br/> Nota: maneggiare il campione con cura e non toccare la superficie per evitare la distruzione della maglia di tessuto non tessuto e di evitare ogni inquinamento. Assicurarsi di creare un numero sufficiente di campioni di pari qualità per misure di performance.

Representative Results

Electrospinning di soluzioni seta ragno ricombinanti con concentrazioni del 10% w / v di HFIP comportato fibre lisce con diametri da 80 a 120 nm, permettendo la formazione di maglie non tessuti. Post-trattamento con vapori di etanolo non ha portato a cambiamenti morfologici evidenti, che è stato, pertanto, istituito come un modo corretto di seta tessuto post-trattamento (Figura 8). I cambiamenti strutturali sono stati rilevati utilizzando FT-IR e la successiva FSD di mezzo io band è stata effettuata per analizzare i picchi singolo contributo (Figura 6). Si è potuto dimostrare che il post-trattamento porta ad un aumento di strutture β-sheet, mentre il contenuto di und strutture random coil α-elicoidali diminuisce (Figura 7). Questo risultato può essere praticamente dimostrata immergendo un post-trattato non tessuto in acqua (Figura 5). Anche dopo una settimana, si verificherà alcuna dissoluzione della mesh non tessuto. La filatura durazione è il parametro più importante riguardante l'applicazione di tessuti non tessuti di seta in materiali filtranti a causa della caduta di pressione in base alla crescente densità delle fibre elettrofilate. Esteso filatura durate und così un maggior numero di strati in fibra risultato una diminuzione esponenziale di permeabilità all'aria. Questo effetto potrebbe essere rilevata per tutti i diversi materiali di substrato filtro prima e dopo il trattamento (Figura 9). Analogamente, l'efficienza di filtrazione dei materiali filtranti seta contenenti particelle sub-micrometriche aumenta (Figura 10). Anche brevi periodi di filatura (30 sec) guadagnano basse efficienze filtranti superiori durate filatura (90 sec) portano ad una maggiore efficienza. Figura 1. Elevata tensione elettrica (0-30 kV) i s applicato ad una siringa riempita con una soluzione di seta, ed un controelettrodo (0-20 kV) viene posto in una distanza di 8-20 cm. Questa configurazione porta ad un forte campo elettrostatico, inducendo forze repulsive all'interno della soluzione carica. Se la tensione superficiale viene superato, un cono Taylor si forma, e un getto sottile scoppia dalla punta. Dopo la formazione, le instabilità di flessione si verificano all'interno del getto causando ulteriore allungamento come il solvente evapora, e una fibra solida è formata. Infine, la fibra viene depositato in modo casuale sulla controelettrodo nella forma di una maglia non tessuto. Figura 2. Fotografie di un regolare Taylor cono (A), una gocciolina essiccata (B), e la configurazione senza gocciolina (C). iles/ftp_upload/50492/50492fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50492/50492fig3.jpg "/> Figura 3. Procedura schematica durante vapore post-trattamento. Nella prima fase, la camera è piena di etanolo, e il campione è cotto a vapore a 60 ° C per 90 min. Al fine di ammorbidire le maglie non tessuti per la successiva manipolazione, l'etanolo viene rimosso e le fibre sono cotte a vapore con vapore d'acqua per 90 min a 60 ° C. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 4. Fotografia di un telaio di cartone con annessi maglie non tessuti di seta da utilizzare per il post-trattamento. Figura 5. ElectrospNazioni Unite e successivamente post-trattamento non tessuto in stato secco (A) e sotto l'acqua (B). Figura 6. Fourier auto-deconvoluto assorbanza spettro di una ammide I banda di un non trattato (A) e un post-trattato (B) seta di ragno non tessuto mesh. La linea continua mostra la banda di assorbanza risultante dai picchi di singolo contributo (linee tratteggiate) come derivata dopo deconvoluzione. L'assegnazione delle rispettive curve si è basata su valori precedentemente pubblicati dalla letteratura 22. Clicca qui per ingrandire la figura . <img alt="Figura 7" fo:conten t-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50492/50492fig7highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50492/50492fig7.jpg" /> Figura 7. Contenuto di struttura secondaria di maglie non tessuti non trattati e post-trattato eADF4 (C16). Figura 8. Immagini SEM di electrospun eADF4 (C16)-fibre su diversi substrati di filtro: poliammide (PA), poliestere (PE), polipropilene (PP) e puro eADF4 (C16) le fibre prima (S1) e dopo (S2) post- trattamento con il vapore di etanolo. Clicca qui per ingrandire la figura . / Ftp_upload/50492/50492fig9.jpg "/> Figura 9. Prove di permeabilità dell'aria, prima (A) e dopo il trattamento (B) della seta maglie non tessuto con vapore di etanolo, aumentando i tempi di filatura portano a più strati non tessuti abbassando successivamente la permeabilità all'aria. Figura 10. Efficienza di aerosol di-etil-esil-sebacat su elettrofilati seta di ragno maglie non tessuto di poliammide materiali filtranti a diverse durate spinning, che influiscono sulla quantità strato di seta, dopo il trattamento con etanolo.

Discussion

Nuovi dispositivi filtranti devono consentire l'abbassamento del consumo complessivo di energia nella filtrazione aria a costanti o superiore efficienza del filtro. Qui, tali dispositivi sono stati creati utilizzando tessuti realizzati in seta di ragno. Grazie alla sua bassa tensione superficiale ed elevata volatilità, HFIP è stato scelto come solvente adatto al processo electrospinning. Inoltre, le soluzioni acquose di seta sono stati testati in esperimenti precedenti, ma non le fibre potrebbero essere generati. Qui, sarebbe fondamentale utilizzare additivi al fine di abbassare la tensione superficiale e quindi migliorare le proprietà di filatura della soluzione. La fase più critica è quello di regolare le condizioni e la concentrazione di materiale utilizzato e solvente della soluzione di filatura, filatura altezza, tensione e velocità di estrusione. Durante la prestazione, per esempio intasamento della punta può essere impedita, fornendo la punta dell'ago con l'umidità sotto forma di vapore acqueo, ma qualsiasi tipo di aggiunte nel setup electrospinning possano successivamente disturbareil processo sensibile e campo elettrico. Parametri di processo essenziali (concentrazione, tensione, distanza, umidità) sono stati determinati individualmente svolgimento serie sperimentale separato (dati non riportati). Prendendo in considerazione tutti i parametri è fondamentale per prendersi cura di un sarto cono continuo e processo di filatura per creare fibre uniformi.

L'efficienza del filtro è uno dei parametri più importanti di materiali filtranti. Questo parametro è influenzato principalmente dalla struttura del materiale filtrante. Wovens ereditano dimensioni dei pori uniformi e successivamente coerente permeabilità all'aria. È fondamentale creare omogenee maglie su questi materiali non tessuti template per riempire i pori e generare un filtro zero difetti. L'efficienza del filtro in nostri filtri mostra una dipendenza diretta sulla durata filatura (delle proteine ​​della seta), e, pertanto, il numero di strati di maglie non tessuti. Gli spazi tra le fibre singole sono costantemente riempiti, consentendo il mantenimento of particelle più piccole.

In questo lavoro abbiamo presentato un metodo per produrre un materiale filtrante romanzo con seta di ragno maglie non tessuti, mostrando ad alta efficienza filtrante. Pertanto, questi filtri sono candidati promettenti per il futuro utilizzo nei sistemi di filtrazione dell'aria.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Noi riconosciamo con gratitudine il supporto tecnico e scientifico di Anja Lauterbach (Lehrstuhl Biomaterialien), Lorenz Summa (Sandler AG) e Armin Boeck (B / S / H / G). SEM-l'imaging è stata eseguita da Johannes Diehl (Lehrstuhl Biomaterialien). Il finanziamento è stato derivato da BMBF (01RB0710).

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Spider Silk ProteinEADF4(C16)ElectrospinningNonwoven MeshAir FilterFilter EfficiencyFTIRBeta-sheetAlpha-helixHFIPFormic AcidHydrophobicityParticle Deposition

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Lang, G., Jokisch, S., Scheibel, T. Air Filter Devices Including Nonwoven Meshes of Electrospun Recombinant Spider Silk Proteins. J. Vis. Exp. (75), e50492, doi:10.3791/50492 (2013).
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