RNA interferens (RNAi) er RNA-baserte post-transkripsjonell genet stanse, som forekommer i en rekke forskjellige eukaryote organismer. Prosessen med RNAi utløses av endogene eller eksogene dobbelt-trådet RNA (dsRNA) forløpere. Den dsRNA aktiverer ribonuklease protein Dicer som binder og kløyver dsRNA til små fragmenter (20-25 bp). Da de små fragmenter av dsRNA guiden en anerkjennelse og spalting av komplementære mRNA ved Argonaute proteiner, en katalytisk komponent av RNA-induced Slå kompleks (RISC) ^1. I pattedyr, dsRNAs lengre enn 30 nt, aktivere en antiviral respons (interferon respons, IFN) som fører til uspesifikke degradering av RNA transkripsjoner ^to. Men har lange dsRNAs vist seg å være effektiv og spesifikk i insekter siden det er mangel på denne IFN ^tre.

Lange dsRNAs har blitt brukt for downregulation av målet gener i forskjellige insektarter. Honningbier er en av pionEER insekt organismer der funksjoner av mange viktige gener i utvikling og atferd har blitt avslørt ved hjelp dsRNA ^4,5. Flere dsRNA levering metoder har blitt utført i honningbier: dsRNA fôring effektivt nedregulerer target genuttrykk i honningbie larver ^6, mens dsRNA injeksjon er en effektiv metode for genet knockdown i honningbie embryoer ^fire og voksne bier ^7,8.

Genet knockdown effekter utstilt ved å bruke dsRNA til insekter er forbigående og lokalisert. Studier har vist at både abdominal dsRNA injeksjoner og thorax dsRNA injeksjoner effektivt undertrykke target genuttrykk i abdominal fett celler i kroppen av insekter ^9,10. DsRNA injiseres i mage-og thorax hulrom og fett celler i kroppen er i stand til å ta opp den dsRNA fra hemolymfe hvor cellene er badet ^10.. Imidlertid kan gener i andre organer, som for eksempel eggstokkene og hjerner, ikke bli målrettet av entenabdominal eller thorax injeksjoner. For å målrette gener i honningbie hjernen, har hjernen injeksjon av dsRNA også blitt utført, noe som effektivt påvirker target genuttrykk i lokale hjerneområder ^11. Her har vi bare dokumentere abdominal dsRNA injeksjon som er mer vanlig hos voksne honningbier.

Rnai har primært vært brukt for å målrette et enkelt gen og har vært et kraftig verktøy for å avsløre gen-funksjon. Imidlertid er en hvilken som helst gen som ikke isolerte fra hverandre, og det er i komplekse regulatoriske nettverk. En nøkkel til å forstå en biologisk prosess er å dissekere hvordan gener samhandler med hverandre, noe som krever samtidige manipulasjoner av flere gener snarere enn et enkelt gen knockdown. I pattedyrcellelinjer, har forskere lykkes i å samtidig hemme to eller tre gener ved hjelp av leveringssystemer ¹² eller multi-mikroRNA (miRNA) hårnål design ^13. Men i insekter, flere genet knockdowns er fortsatt uprøvd. Her presentasjon vit forskjellige injeksjon strategier som kan oppnå en dobbel genet knockdown. Vi målretter to gener: Vitellogenin (VG) som koder for et protein forløper eggeplomme, og ultraspiracle (USP) som koder for en antatt reseptor for juvenilt hormon (JH) og kan tjene som en transkripsjonsfaktor mediere responser i JH ¹⁴ i honning bier. Vg og JH regulere hverandre i en tilbakekoblingssløyfe ¹⁵ og er involvert i honningbie atferdsmessige regulering ^9.. Ved hjelp av den doble genet knockdown, vi forstyrre både Vg og JH trasé, og oppdage hvordan de i fellesskap påvirke honningbie atferd og fysiologi og hvordan vg, usp og JH samhandle ^ni.

Gustatory oppfatning er et atferdsmessig prediktor for honningbie sosial atferd ^16. I form av atferdsmessige utvikling, hekker bier med høy gustatory oppfatning behaviorally modne raskt, og vanligvis grovfôr tidlig i livet, og foretrekker å samle pollen ^16,17. Selv regulatoriske mechanisms underliggende gustatory oppfatning er fortsatt uklart, har studier vist at gustatory oppfatning er knyttet til interne energi metabolisms ^9, hormonelle sekret ^18,19 og biogenetic amin veier ^20. Både VG og JH er viktige hormonelle regulatorer modulerende gustatory oppfatning ^7,21. I laboratoriet, kan en variant av gustatory persepsjon i honning bier bli evaluert ved å teste snabel forlengelse respons (PER) til forskjellige sukrose-løsninger. Hver bie testes ved å berøre begge hennes antenner med en dråpe med vann fulgt av en stigende konsentrasjon serie av 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% sukrose. En positiv respons er kjent hvis en bie fullt strekker hennes snabel når en dråpe vann eller sukrose er berørt til hver antenne. Basert på antallet av positive respons på løsninger, kan den gustatory oppfatning nivå av hver enkelt bestemmes ^16. Imidlertid er anvendelsen av PER ikke begrenset til måling gustatory oppfatning. PER er også en effektiv metode for å teste den metabolske tilstand av bier som metning vs sult. Biene med større respons på sukrose er sulten generelt (Wang og Amdam, upubliserte data). Videre kan PER paradigmet også brukes i assosiative læring og hukommelse i honning bier. I dette tilfellet bier vil bli trent til å assosiere tilstedeværelse av sukrose vann med en lukt. Når biene lære foreningen kan bare tilstedeværelsen av lukt fremkalle en positiv snabel respons uten å belønne dem med sukrose ^22,23. I denne videoen viser vi hvordan du utfører PER å vurdere gustatory oppfatning som har vært knyttet til vg og usp dobbel knockdown i en tidligere studie ^ni.