Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina
Summary
Questo articolo si concentra sulla identificazione di alta fiducioso set di dati di interazione tra ospite e patogeno proteine usando una combinazione dei due metodi ortogonali: lievito di doppio ibrido seguita da un saggio di interazione high-throughput in cellule di mammifero chiamato HT-GPCA.
Abstract
Notevoli sforzi sono stati raccolti per produrre proteina-proteina mappe di rete di interazione su larga scala globale. Questo è fondamentale per comprendere le relazioni patogeno-ospite ed è stata eseguita essenzialmente da screening genetico nei lieviti sistemi a due ibridi. Il recente miglioramento della rilevazione interazione proteina-proteina da una luciferasi-based test di complementazione frammento Gaussia offre ora l'opportunità di sviluppare approcci comparativi interactomic integrativi necessari per confrontare rigorosamente profili di interazione di proteine provenienti da diverse varianti di ceppo patogeno nei confronti di un insieme comune di fattori cellulari.
Questo documento si concentra in particolare sulla utilità di combinare due metodi ortogonali per generare proteina-proteina set di dati di interazione: lievito di due ibridi (Y2H) e un nuovo saggio, high-throughput Gaussia princeps saggio di complementazione proteica (HT-GPCA) eseguita in cellule di mammifero.
nt "> A identificazione su larga scala di partner cellulari di una proteina patogeno viene eseguita con l'accoppiamento a base di lievito proiezioni doppio ibrido di librerie di cDNA utilizzando molteplici varianti ceppo patogeno. Un sottoinsieme di partner interagenti selezionati su un punteggio alto confidenza statistica è ulteriormente convalidato in cellule di mammifero per le interazioni pair-wise con l'intero insieme di proteine varianti patogeni utilizzano HT-GPCA. Questa combinazione di due metodi complementari migliora la robustezza del set di dati di interazione, e consente l'esecuzione di una rigorosa analisi di interazione comparativa. Tali intergenomica comparativi costituire una strategia affidabile e potente per decifrare eventuali interazioni patogeno-ospite.Introduction
La crescente quantità di dati raccolti per generare mappe di interazione proteina-proteina apre prospettive per comprendere ulteriormente infezioni da patogeni. Poiché la comprensione globale di infezioni patogeno comincia ad emergere, fornisce accesso alla gamma delle perturbazioni indotte dalle proteine patogeni quando si collega il proteoma umano 1. E 'in tal modo offre un modo per capire come gli agenti patogeni manipolano il macchinario della cellula ospite. In particolare, la mappatura delle diverse reti di interazione virus-ospite ha rivelato che le proteine virali preferenzialmente proteine bersaglio host che sono fortemente connessi alla rete cellulare (hub), o che sono al centro di molti percorsi in una rete (proteine colli di bottiglia) 2-4. Queste interazioni consentono ai virus di manipolare importanti processi cellulari, che è strumentale per replicare e produrre progenie infettiva. Mappatura interazioni comparativi sono stati recentemente condotto sul virus collegati con l'obiettivo di estrarre le informazioni relative alpatogenesi 4. Inoltre, gli studi di host-patogeni interazioni paesaggio sono stati estesi a molti agenti patogeni 5. La cella di identificazione fattori mirata fornisce approfondimenti sulle strategie utilizzate da agenti patogeni di infettare le cellule e permette di individuare i potenziali marcatori patogeni.
Il sistema di doppio ibrido di lievito è il metodo più popolare per identificare interazioni binarie poiché lo screening genetico è uno strumento efficace e sensibile per la mappatura ad alta velocità di interazioni proteina-proteina. L'approccio qui proposto migliora ulteriormente le singole proiezioni Y2H valutando una proteina di molteplici agenti patogeni varianti di deformazione, fornendo così accesso ad una panoramica comparativa delle interazioni proteina-proteina patogeno-ospite. Inoltre, una limitazione importante di lievito di screening del doppio ibrido giace in un alto tasso di falsi negativi, poiché recupera circa il 20% delle interazioni totale 6. Ciò implica che le interazioni rilevate con solo un sottoinsieme di patogens varianti potrebbero essere sfuggiti al rilevamento con gli altri. Pertanto, i singoli partner emergenti di tutte le proiezioni di due ibridi sono ulteriormente sfidati per l'interazione con l'intera gamma di ceppi studiati, fornendo serie di dati comparativi di interazione. Poiché è stato dimostrato che la combinazione di differenti metodologie fortemente aumenta la robustezza di interazione proteina-proteina set di dati 7, questa convalida viene eseguita in cellule di mammifero mediante un saggio di complementazione proteina-frammento di recente sviluppato chiamato HT-GPCA 8. Questo sistema a base di cellule permette il rilevamento di interazioni proteina dalla complementazione del Gaussia princeps diviso luciferasi ed è stato progettato per essere compatibile con un formato ad alta produttività. Grazie alla sua tecnologia di luminescenza-based e il suo basso rumore di fondo rispetto ad altre analisi basato sulla fluorescenza, HT-GPCA mostra una sorprendentemente elevata sensibilità.
In generale, questo approccio costituisce un efficientestrumento per generare una mappatura completa delle interazioni ospite-patogeno, che rappresenta il primo passo verso una comprensione globale della cellula ospite dirottamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Indipendentemente, lievito-due saggi di interazione ibridi e mammiferi, come il GST pull-down, LUMIER o MAPPIT, hanno dimostrato di essere strumenti efficaci per individuare le interazioni proteina-proteina, ma sono limitati dal tasso elevato di falsi positivi e falsi negativi interazioni associate con queste tecniche 15. Inoltre, vi è sempre maggiore che combinando metodi ortogonali aumenta l'affidabilità dell'interazione dataset ottenuto 7. Il recente sviluppo della tecnica HT-GPCA desc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un finanziamento della Institut Pasteur e da finanziamenti della Ligue nationale contre le Cancer (sovvenzioni R05/75-129 e RS07/75-75), l'Associazione pour la Recherche sur le Cancer (borse di ARC A09 / 1/5031 e il 4867), e l'Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 e ANR09 MIEN 026 01). MM è stato un destinatario di una borsa di studio MENRT.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
References
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