Separación de los<em> Plasmodium falciparum</em> Late Stage-eritrocitos infectados por medios magnéticos
Summary
Las propiedades paramagnéticas de hemozoína se utilizan para aislar las últimas etapas de<em> Plasmodium falciparum</em>-Infectados glóbulos rojos que crecen en cultivo. El método es simple y rápido y no afecta a las capacidades invasivas posteriores de los parásitos.
Abstract
A diferencia de otras especies de Plasmodium, P. falciparum pueden ser cultivados en el laboratorio, lo que facilita su estudio 1. Mientras que la parasitemia alcanzado puede alcanzar el límite de ≈ 40%, el investigador normalmente impide que el porcentaje en torno al 10%. En muchos casos es necesario aislar las células rojas de parásito que contienen la sangre (glóbulos rojos) de los no infectados, para enriquecer la cultura y proceder con un experimento dado.
Cuando P. falciparum infecta los eritrocitos, el parásito se degrada y se alimenta de hemoglobina 2, 3. Sin embargo, el parásito debe tratar con un resto hemo muy tóxico que contiene hierro 4, 5. El parásito elude su toxicidad mediante la transformación del hemo en un polímero de cristal inerte llamada haemozoin 6, 7. Esta molécula que contiene hierro se almacena en su vacuola alimentaria y el metal en él tiene un estado de oxidación que difiere de la de hemo 8. El estado férrico de hierro en el grupo hemoozoin le confiere una propiedad paramagnética ausente en los eritrocitos no infectados. Como el parásito invasor alcanza la madurez, el contenido de haemozoin 9 también aumenta, lo que confiere paramagnetismo aún más en las últimas etapas de P. falciparum en el interior de los eritrocitos.
En base a esta propiedad paramagnética, las últimas etapas de la P. falciparum infectados células rojas de la sangre pueden ser separadas haciendo pasar la cultura a través de una columna que contiene perlas magnéticas. Estas perlas se vuelven magnéticos cuando las columnas contienen se coloca en un soporte de imán. Eritrocitos infectados, debido a su paramagnetismo, entonces quedará atrapado en el interior de la columna, mientras que el flujo a través contendrá, en su mayor parte, los eritrocitos no infectados y aquellos que contienen etapas tempranas del parásito.
Aquí, se describe la metodología para enriquecer la población de parásitos en fase tardía con columnas magnéticas, lo que mantiene la viabilidad del parásito buena 10.Después de realizar este procedimiento, la cultura no unida puede ser devuelto a una incubadora para permitir que los parásitos restantes para continuar creciendo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los cultivos in vitro del parásito de la malaria P. falciparum presentan una parasitemia limitada, con más de la mitad de las células rojas de la sangre infectadas en el punto más alto de la proliferación de cultivo. Para la mayoría de los experimentos de investigación, es deseable para trabajar sólo con los eritrocitos infectados. Con este fin, una técnica de separación es necesario dividir el cultivo de acuerdo a la infección. Los métodos útiles incluyen el uso de estreptolisina…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el subsidio PRB-009 para CS y una beca doctoral a LC, de la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT) de Panamá, Panamá.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway. J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).
- Rosenthal, P. J., Meshnick, S. R. Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites. Mol. Biochem. Parasitol. 83 (2), 131-139 (1996).
- Fitch, C. D., Chevli, R., Kanjananggulpan, P., Dutta, P., Chevli, K., Chou, A. C. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent. Blood. 62 (6), 1165-1168 (1983).
- Hebbel, R. P., Eaton, J. W. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane. Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).
- Egan, T. J. Haemozoin formation. Mol. Biochem. Parasitol. 157 (2), 127-136 (2008).
- Hempelmann, E., Marques, H. M. Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).
- Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment. J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).
- Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis. FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).
- Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation. Malaria J. 10, 96 (2011).
- Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II. Biochem. J. 403, 167-175 (2007).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).
- Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).
- Pertoft, H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. The Lancet. 318, 70-71 (1981).
- Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells. Malar. J. 3, 7 (2004).
- Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites. Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).
