Separazione dei<em> Plasmodium falciparum</em> Fine Stage-eritrociti infettati da mezzi magnetici
Summary
Le proprietà paramagnetiche di emozoina sono utilizzati per isolare fasi avanzate della<em> Plasmodium falciparum</em>-Infetti globuli rossi crescono in coltura. Il metodo è semplice e veloce e non influenza le capacità invasive successive dei parassiti.
Abstract
A differenza di altre specie di Plasmodium, P. falciparum possono essere coltivate in laboratorio, che facilita lo studio 1. Mentre la parassitemia ottenuto può raggiungere il limite ≈ 40%, l'investigatore tiene normalmente la percentuale intorno al 10%. In molti casi è necessario isolare il parassita contenenti globuli rossi (RBC) da quelli non infetti, ad arricchire la cultura e procedere con un dato esperimento.
Quando P. falciparum infetta il eritrociti, il parassita si degrada e si nutre da emoglobina 2, 3. Tuttavia, il parassita deve fare i conti con una molto tossica contenente ferro eme parte 4, 5. Il parassita sfugge sua tossicità trasformando l'eme in un polimero a cristalli inerte chiamato haemozoin 6, 7. Questa molecola contenente ferro viene memorizzato nel suo vacuolo alimentare e il metallo in esso ha uno stato ossidativo che differisce da quella in eme 8. Stato ferrico di ferro nel emeozoin le conferisce una proprietà paramagnetica assente negli eritrociti non infetti. Come il parassita invade raggiunge la maturità, il contenuto di haemozoin aumenta anche 9, che conferisce paramagnetismo ancora di più le ultime fasi di P. falciparum all'interno degli eritrociti.
Sulla base di questa proprietà paramagnetica, le ultime fasi di P. falciparum infetto-globuli rossi possono essere separati facendo passare la cultura attraverso una colonna contenente biglie magnetiche. Queste perle diventare magnetico quando le colonne che li contengono sono disposti su un supporto magnetico. RBC infetti, a causa della loro paramagnetismo, verrà intrappolata all'interno della colonna, mentre il flusso attraverso conterrà, per la maggior parte, eritrociti infetti e quelle contenenti fasi iniziali del parassita.
Qui, descriviamo la metodologia per arricchire la popolazione di parassiti fase avanzata con colonne magnetiche, che mantiene una buona redditività parassita 10.Dopo aver eseguito questa procedura, la cultura distaccato può essere restituito ad un incubatore per consentire ai parassiti rimanenti per continuare a crescere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nelle culture in vitro di parassita della malaria P. falciparum mostrano una parassitemia limitata, con più della metà dei globuli rossi non infettate nel punto più alto proliferazione di cultura. Per esperimenti più ricerca, è desiderabile lavorare solo con gli eritrociti infetti. A tal fine, una tecnica di separazione è necessario dividere la coltura secondo l'infezione. Metodi utili includono l'uso di streptolisina O a permeabilize e Lyze gli RBC non infetti 11 e un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione PRB-009 per CS e una borsa di studio di dottorato di LC, dal Nacional Secretaría de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panama.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
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