הפרדה<em> Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים> שלב מאוחר נגועים באמצעי מגנטי
Summary
את המאפיינים של פאראמגנטיים hemozoin משמשים כדי לבודד שלבים מאוחרים של<em> Plasmodium falciparum</emתאים> נגועים-דם אדומים הגדלים בתרבות. השיטה היא פשוטה ומהירה ואינו משפיעה על היכולות פולשניות הבאות של הטפילים.
Abstract
בניגוד למינים אחרים Plasmodium, פ falciparum יכול להיות מתורבת במעבדה, המאפשרת המחקר שלה 1. בעוד parasitemia הושג יכול להגיע לגבול ≈ 40%, החוקר בדרך כלל שומר על אחוז בסביבות 10%. במקרים רבים יש צורך לבודד את תאי טפיל המכילים דם האדומים (RBCs) מאלה הנגועים, כדי להעשיר את התרבות ולהמשיך בניסוי נתון.
כאשר פ falciparum מדביק הכדורי האדום, הטפיל מפרק ונזון מהמוגלובין 2, 3. עם זאת, הטפיל צריך לטפל במחצית רעילה מאוד המכיל ברזל haem 4, 5. הטפיל חומק רעילותו על ידי הפיכת haem לתוך פולימר אינרטי גביש קרא 6 haemozoin, 7. מולקולה המכיל ברזל זה מאוחסן בvacuole המזון והמתכת שביש מצב חמצונים שונים מהאחד בhaem 8. מצב הברזל של ברזל בhaemozoin מעניק לו רכוש פאראמגנטיים נעדר באריתרוציטים הנגועים. כטפיל הפולש מגיע לפדיון, תוכן haemozoin גם מגדיל 9, שמעניק עוד יותר paramagnetism בשלבים האחרונים של פ falciparum בתוך כדורי האדום.
בהתבסס על נכס זה פאראמגנטיים, בשלבים האחרונים של פ תאי דם אדומים נגועים falciparum יכולים להיות מופרדים על ידי עובר דרך תרבות עמודה המכילה חרוזים מגנטיים. חרוזים אלו הפכו מגנטיים כאשר העמודות שמכילות אותם מונחות על בעל מגנט. RBCs הנגוע, בשל paramagnetism, אז יהיה לכוד בתוך הטור, ואילו זרימה דרך יכיל, על פי רוב, אריתרוציטים נגועים ואלו שלבים מוקדמים של המכילים את הטפיל.
כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה להעשרת האוכלוסייה של טפילים בשלב מאוחר עם עמודות מגנטיות, אשר שומרת על יכולת קיום טפיל טובה 10.לאחר ביצוע הליך זה, התרבות הפנויה יכולה להיות מוחזרת לאינקובטור על מנת לאפשר לטפילים שנותרו להמשיך ולצמוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
בתרבויות מבחנה של המלריה הטפילה פ falciparum תערוכת parasitemia מוגבל, עם יותר ממחצית תאי הדם האדומים הנגועים בנקודה הגבוהה ביותר של התפשטות התרבות. עבור רוב ניסויי מחקר, רצוי לעבוד רק עם אריתרוציטים הנגועים. לשם כך, טכניקת הפרדה היא הכרחית כדי לחלק את התרבות בהתאם לז?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענק PRB-009 לCS ומלגת דוקטורט לLC, מSecretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT), פנמה.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway. J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).
- Rosenthal, P. J., Meshnick, S. R. Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites. Mol. Biochem. Parasitol. 83 (2), 131-139 (1996).
- Fitch, C. D., Chevli, R., Kanjananggulpan, P., Dutta, P., Chevli, K., Chou, A. C. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent. Blood. 62 (6), 1165-1168 (1983).
- Hebbel, R. P., Eaton, J. W. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane. Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).
- Egan, T. J. Haemozoin formation. Mol. Biochem. Parasitol. 157 (2), 127-136 (2008).
- Hempelmann, E., Marques, H. M. Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).
- Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment. J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).
- Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis. FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).
- Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation. Malaria J. 10, 96 (2011).
- Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II. Biochem. J. 403, 167-175 (2007).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).
- Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).
- Pertoft, H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. The Lancet. 318, 70-71 (1981).
- Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells. Malar. J. 3, 7 (2004).
- Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites. Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).
