In Vivo modélisation du génome humain morbide utilisant Danio rerio

Maladies récessives et Pseudorecessive Les cils primaires sont des structures quasi-omniprésent sur ​​le plan du corps des vertébrés qui jouent cellulaires rôles de signalisation dans plusieurs destins cellulaires, y compris la prolifération, la polarité, la différenciation et l'entretien des tissus. 5 dysfonctionnement de ces organites conduit à un large éventail de troubles génétiques humaines dénommés collectivement comme ciliopathies. 6,7 Une telle entité clinique est le syndrome de Bardet-Biedl (BBS), un trouble pédiatrique multisystémique caractérisée par une dégénérescence rétinienne, l'obésité, l'hypogonadisme, polydactylie, et la dysfonction rénale. 7 Le développement d'essais in vivo de la pathogénicité de l'allèle était nécessaire pour BBS parce que a) il s'agit d'un trouble génétiquement hétérogène causée par des changements non synonymes principalement privés survenant chez au moins 17 gènes 7-10, et b) l'héritage oligogénique dans> 25% des familles du BBS, dans lequel la présence de changements hétérozygotes dans un secondGène BBS (en plus de récessives mutations causales primaires) peut moduler la pénétrance clinique et expressivité. Typiquement, ces allèles tiers sont des changements non synonymes hétérozygotes, d'un point de vue génétique, le potentiel pathogène incertain, nécessitant une interprétation exacte de leur effet biologique sur la fonction des protéines 11-13. Pour étudier le potentiel pathogène des mutations qui contribuent à charge mutationnelle dans BBS, nous avons d'abord testé tous les changements de faux-sens identifiées dans BBS1 – BBS14. Nous et d'autres ont montré que la perte de protéines basale du corps donne lieu à une dysrégulation de la polarité cellulaire planaire (PCP; signalisation Wnt non canonique). Manifestant comme des défauts d'extension convergentes dans des embryons de poisson zèbre mi-somitiques 14 Utilisation de cette lecture phénotypique physiologiquement pertinents, nous ont constaté que la suppression de gènes BBS entraîné axes raccourcissement du corps, somites plus larges et plus mince et large, notochords plié. 15 </ Sup> (Figure 2) suppression MO induite produite défauts de gastrulation, et co-injection avec de l'ARNm de l'homme sauvé de manière significative (et reproductible) ces phénotypes aussi marqué par trois différentes méthodes in vivo. D'abord, les embryons ont été marqués en direct selon des critères phénotypiques qualitatives (Normal, classes I et II, pour des définitions détaillées des classes phénotypiques voir 15). Ensuite, nous avons quantifié la migration cellulaire pendant épibolie (un stade précoce du développement caractérisé par l'amincissement et la propagation des couches de cellules sur la cellule jaune 16) en utilisant un traceur fluorescéine pour visualiser les cellules migrent. Enfin, nous avons mesuré la longueur du tronc somites chez les embryons de neuf somites in situ hybridées avec un cocktail de Krox20, PAX2 et ribosondes MYOD, qui ont été montés à plat pour l'analyse morphologique. Cette méthodologie a été utilisée pour tester plus de 500 allèles dans l'espace mutationnel ciliaire. Dans unseule étude, les essais in vivo de> 130 allèles produit une gamme de scores phénotypiques, comme indiqué par notre protocole (Figure 1) complète sauvetages ont été classés comme bénins (non significativement différent de WT sauvetage), partielle sauvetages ont été classés comme hypomorphs (nettement améliorée de MO, mais plus sévère que WT sauvetage), l'insuffisance de sauvetage ont été classés comme non fonctionnelle (pas significativement différent de MO), et les phénotypes induits par l'ARNm mutant seuls comparativement à MO ont été classés comme négatifs dominants. Nous avons également évalué la sensibilité et la spécificité du test in vivo de complémentation chez le poisson zèbre. La spécificité a été confirmée par co-injection SNP communs (> 5% la fréquence de l'allèle mineur dans les populations témoins en bonne santé), qui ont été trouvés à donner phénotypes bénins chez 14/17 testé (> 82%), et la sensibilité ont été présentés à 98% comme indiqué par concordance entre les données in vivo et des arguments génétiques suffisant to attribuer un allèle de causalité dans un BBS pedigree. 17 En outre, les effets phénotypiques observées en utilisant les trois mesures in vivo (score en direct, le suivi épibolie, et ISH morphométriques) ont été validés in vitro en utilisant des études de localisation immunoblot et cellulaire. Bien que l'interprétation de ces résultats Prérequis au moins un mécanisme de la pathogenèse de la maladie, cet exemple permet de preuve pour étayer l'utilité et la solidité de notre protocole. Depuis, nous avons corroboré notre meilleur marqueur in vivo avec plusieurs autres éléments de preuve expérimentale dans un criblage mutationnel impartiale et étude de l'analyse fonctionnelle des TTC21B, une protéine de transport intraflagellaire rétrograde. 18 Troubles dominantes Dystrophies musculaires des ceintures (LGMD) sont une classe autosomique de la dystrophie musculaire, provoquant lente faiblesse musculaire progresse dans les hanches et les épaules. Cette génétiquement et moichanistically groupe hétérogène de maladies est causée par des mutations dominants et récessifs dans sarcolemmique multiple, sarcomériques, cytoplasmiques et les protéines nucléaires. Basé sur la présentation des phénotypes cliniques et des preuves de l'implication du muscle à partir de l'imagerie par résonance magnétique, nous avons enquêté sur la cause d'un LGMD dominante trouvé en finnois, États-Unis, et 19 familles italiennes. Le séquençage des candidats de position dans le locus mappé révélé des mutations dans DNAJB6, un gène codant pour une co-chaperon de la famille HSP70 exprimé en au moins deux isoformes d'épissage (nucléaire et cytoplasmique) chez les humains. Pour obtenir de nouvelles informations sur DNAJB6 fonction et sa pertinence pour LGMD, nous avons examiné son rôle dans l'intégrité du muscle chez le poisson zèbre. RT-PCR du poisson-zèbre orthologue (dnajb6b) détecté expression dès le stade de cinq somites, qui a été suivie par l'injection d'embryons avec une épissure bloquant morpholino. À 48 h après la fécondation, la notation masqué a montré détachement de la lenteurfibres à partir de leurs points d'insertion. La spécificité de ce phénotype a ensuite été testé avec un second MO non-cumul et secouru par la suite avec WT DNAJB6 ARNm humain. Pour interroger comment la perte de DNAJB6 fonction conduit à des défauts dans l'intégrité musculaire, nous avons introduit des mutations faux-sens trouvées chez les patients dans les transcriptions de l'homme des deux isoformes et les ont injectées dans des embryons de poisson zèbre. Tandis que l'injection de l'ARNm humain WT produit aucun phénotype appréciable, ces changements phénocopies la perte des effets de fonction du MO lorsque conçu dans le cytoplasme, mais pas isoforme nucléaire. Elle a été suivie par co-injection de quantités équimolaires de l'ARNm mutant et WT, qui a montré une meilleure sévérité du phénotype musculaire, ce qui suggère un effet dominant. Pour tester cette idée, d'autres injections ont été réalisées avec la modification des rapports molaires de l'ARNm mutant et WT. Conformément à la prédiction, un excès d'ARNm mutant par rapport à létalité induite WT dans les embryons, tandis qu'unn plus de WT produit un sauvetage progressivement augmenté. Elle a été suivie par des expériences in vitro pour déterminer les propriétés de oligimerization et les interactions de protéines possibles. Ceux-ci ont montré que les mutations altèrent l'activité anti-agrégation de DNAJB6 cytoplasmique et interfèrent avec chiffre d'affaires des deux mutant et WT, mais aussi d'interagir avec une autre molécule, BAG3, qui est également pertinente pour le mécanisme pathogénique de LGMD, depuis LOF BAG3 provoque une forme pédiatrique de dystrophie musculaire 20. Nous avons ensuite demandé si BAG3 pourrait moduler le phénotype induit par DNAJB6b mutant chez le poisson zèbre. Tandis que l'injection de WT BAG3 seul produit aucun phénotype, co-injection avec DNAJB6 mutants augmenté de façon significative la sévérité phénotypique, ce qui suggère que BAG3 joue un rôle dans la médiation de la pathogénicité de ces mutants 19. Transient poisson zèbre modèle <td> Mutant poisson zèbre ligne Lignée de souris transgénique Âge d'apparition du phénotype humain sous enquête prénatal néonatale pédiatrique prénatal néonatale pédiatrique prénatal néonatale pédiatrique adulte Phénotypes possibles craniofaciale musculaire signalisation cardiaque rénale vasculaire craniofaciale musculaire signalisation cardiaque rénale vasculaire craniofaciale musculaire signalisation cardiaque rénale vasculaire sensoriel squelettique viscérale comportemental respiratoire reproductive endocrinien métabolique Temps jusqu'à l'utilisation (de la naissance) 1-7 jours > 3 mois > 6 mois Débit moyen-élevé faible faible Avantages Possibilité de tester des mutations spécifiques Capacité à générer des modèles knock-in Aptitude à utiliser les passes rabattues morpholino Faible coût d'entretien Moins de variabilité expérimentale Closer relation évolutive Conservation des structures d'organes Possibilité de gènetaux knock-in modèles Tableau 1. Comparaison des modèles in vivo. Tableau 2. Des exemples de la modélisation in vivo de dysmorphologies humaines. Divers phénotypes testés dans le cadre du protocole présenté. Une gamme de lectures phénotypiques et les techniques de visualisation peut être utilisée en fonction du type de trouble. Cliquez ici pour agrandir table. Figure 1. Dans les tests fonctionnels in vivo des variantes non synonymes. Une approche systématique à des tests fonctionnels de touseles de signification inconnue ou supposée. inactivation génique par l'intermédiaire d'un morpholino micro-injection est suivie d'une série de (co) injections de deux WT et ARNm humain mutant. Les analyses statistiques des résultats phénotypiques informer la pathogénicité des allèles et fonction moléculaire. En bref, la perte de tests de la fonction: Si l'effet de choc produit un phénotype qui peut être sauvé de façon équivalente par l'ARNm mutant et WT, l'allèle est probablement bénigne (boîte verte). Si le sauvetage mutant du phénotype knockdown est indiscernable de la phénotype knockdown, l'allèle est un nul fonctionnel probable (zone jaune). Si le sauvetage mutant du phénotype knockdown est statistiquement meilleure que la MO, mais pire que le WT, l'allèle est probablement un hypomorph (boîte verte) Pour les tests dominantes:. Si l'injection d'ARNm mutant est équivalente à celle de l'ARNm de type sauvage , l'allèle peut être soit bénigne ou perte de fonction ou le dosage peut avoir échoué (boîte verte). Si l'injection d'ARNm mutant est indis tinguishable de MO knockdown, la fonction du produit du gène est probablement altéré en quelque sorte. Pour discerner le changement de fonction, titrer ARNm mutant avec l'ARNm de type sauvage. Si le résultat de ce titrage est indiscernable de type sauvage ARNm seul, le produit de la protéine mutante utilise la protéine de type sauvage comme substrat, ce qui indique un phénotype dominant négatif (boîte bleue). Si le résultat de ce titrage est indiscernable à l'ARNm mutant seul, le produit de la protéine mutante n'a plus la même fonction que le type sauvage, et est donc probable un gain de fonction (boîte bleue). Si aucun phénotype présente de MO knockdown, mais il présente l'ARNm WT, une expérimentation plus poussée peut se produire, WT ARNm humain doit être adaptée afin de minimiser le phénotype, et peut également être utilisé comme un nouveau point de consigne. En outre co-injection d'ARNm humain WT et mutant peut être évaluée en fonction de la capacité de sauvetage du mutant (boîte rose).et = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir la figure. Figure 2. L'évaluation quantitative et qualitative des MKS1 mutations détectées chez les humains. Défauts de développement dans MKS1 embryons morphant. Sur la base de la gravité, les phénotypes ont été classés en trois groupes. Des exemples de chaque classe sont affichés (a), et leur prévalence au sein de leur cohorte d'embryons (n = 100-160 embryons) ont été compilés (non représenté). MO injecté embryons de classe I phénotypes avaient grossièrement morphologie normale mais étaient plus courtes, avec des tissus embryonnaires excessive sur le jaune par rapport à contrôler embryons injectés au même âge somites (8-9 somites). Morphants classe II ont été éclaircis, court et ont peu développé la tête et les structures de la queue, et en outre manqué définition somiteset de la symétrie. Embryons de classe III ont été sérieusement retardés avec somites peu développés et difforme, ondulé notochords, et généralement ne survivent pas dépassé le stade de 10 somites. Co-injection de MKS1 ARNm humain sauvé chacun de ces défauts, démontrant la spécificité des phénotypes à MKS1 suppression. L'hybridation in situ d'embryons au stade 11 somites (± 1 somite) colorées avec Krox20, PAX2 et ribosondes MYOD (b, c ). Phénotypes ont été quantifiés par des mesures de la première à la dernière somites appréciable de chaque embryon (flèches), quantifiés dans c. Figure adapté avec la permission de 15. Figure 3. Des exemples de la modélisation in vivo de dysmorphie humaine. (A) une dysmorphie cranio-faciale. ARNm de contrôle injecté embryon (à gauche) et l'embryon injecté mutant (à droite) coloré au bleu Alcian à 5 dpf. Mutants embryons ARNm injectés présentent notamment les petites et difformes têtes avec une désorganisation générale du squelette cranio-facial cartilagineux dont écartés arcs branchiaux et manquantes ou structures malformées. (B) Micro / macrocéphalie. Contrôle non injectée embryon (à gauche) et kctd13 embryon MO-injecté (à droite) à 5 dpf. Morphants afficher l'élargissement de la tête, comme on le voit par l'espace entre les yeux. 21 (c) l'intégrité vasculaire réduit. Contrôle non injectée embryon (en haut) et eng embryon MO-injecté (en bas) imagées par microscopie de fluorescence à 2 DPF dans un FLI1: eGFP ligne de journaliste transgénique. Morphants présentent une déficience germination des navires intersegmentaire et autres structures vasculaires. 41 (d) boucle cardiaque altérée. L'hybridation in situ de l'UNIembryons de type sauvage njected (à gauche) montrent une expression de spaw dans le latéral gauche mésoderme, tandis que CCDC39 embryons morphant montré bilatérale (à droite) ou, dans la plupart des cas, l'expression de spaw indétectable (non représenté). 43 (e) des kystes rénaux. Embryon WT non injectée (en haut) et ift80 morphant (en bas). Morphants affichés gros kystes rénaux (flèche), œdème péricardique (pointe de flèche) et une queue enroulée. 44 (f) filtration glomérulaire réduit. Fluorescent visualisation d'un contrôle injecté embryon (en haut) et ift80 morphant (bas) 24 heures après l'injection de rhodamine dextran dans le coeur. Disperse fluorescence à travers le système vasculaire et est presque complètement évacué par les reins vu l'absence totale de fluorescence dans le contrôle. Le morphant affiche dextran fluorescent persistante, suggérant diminution de la filtration glomérulaire. 46 (g) La dystrophie musculaire. WT DNAJB6 mRNA embryons injectés (en haut) montrent myofibres lents ordinaires couvrant les somites normalement entre myosepta adjacent tel que déterminé par immunologique utilisant un anticorps anti-myosine lente. Mutant DNAJBb (en bas) montre partiel pour compléter détachement des fibres musculaires de myosepta dans un ou plusieurs somites. 19 (h) angle Somite. Magnifié vues latérales en direct de contrôle non injecté (en haut) ou kif7 morphants (en bas) imagées à 30 HPF. Morphants afficher somites forme anormale, attribuables à ectopique de signalisation Hedgehog dans le poisson-zèbre myotomes 47. Tous les chiffres Adapté avec permission.