Embrione di pollo midollo spinale Fetta protocollo Cultura

1. Fai soluzioni necessarie Tampone fosfato 1 M:. Pesare 109,4 g di Na 2 HPO 4 e 32 g di NaH 2 PO 4 H 2 0, mescolare e sciogliere in acqua al volume totale di 1 litro. Soluzione tampone fosfato (PBS): Preparare tampone fosfato 0,1 M, 0,15 M di NaCl. 100 ml di PBS dovrebbe essere sufficiente per il trattamento di fette da 10 embrioni. Agarosio: Calore soluzione di PBS a circa 70 ° C e aggiungere solidi a bassa temperatura di fusione agarosio lentamente, mentre mescolando continuamente. Rendono la soluzione ad una concentrazione finale del 4% (w / v) di agarosio. Fare una scorta di 50 ml di questa soluzione. Lasciare questa soluzione in un bagno d'acqua mantenuto a 48 ° C fino al momento dell'uso. La soluzione di agarosio inutilizzata dopo l'esperimento può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane. Anticorpo soluzione blocco: Aggiungi il siero fetale di vitello e Triton X-100 a un Concentrazione finalezione del 1% (v / v) di siero fetale bovino, 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS. 10 ml di soluzione di blocco sarà sufficiente per la immunocolorazione su 5 vetrini di sezioni al criostato. Fissativo: Preparare NaOH 0,75 millimetri, 4% (w / v) di paraformaldeide (ATTENZIONE). Per preparare fissativo quantità di calore necessaria di acqua a 70 ° C, aggiungere NaOH concentrato a concentrazione finale desiderata, aggiungere paraformaldeide solida e mescolare fino a dissoluzione. Raffreddare su ghiaccio a 4 ° C. 10 ml di questa soluzione è sufficiente per 20 pozzetti di fette embrioni. Saccarosio Soluzione: Preparare 10 ml di una soluzione di saccarosio al 30% (w / v) contenente 0,1 M tampone fosfato. 10 ml di questa soluzione sarà sufficiente per 10 pozzetti di fette embrioni. 70% (v / v) di etanolo. Diluire 70 ml di etanolo assoluto con 30 ml di acqua. Cultura Media: Preparare una soluzione di estratto di pollo 1% degli embrioni, 1% penicillina / streptomicina, 0,35% L-Glutammina, 0,1% 2-mercaptoethanol, 4% siero di pollo, 2% B27 supplemento e 100 ng / ml fattore di crescita ciliaryneurotrophic (CNTF) tutti diluito in terreno Neurobasal; preparata su ghiaccio e usato lo stesso giorno. 10 ml di mezzo di coltura è richiesto per 20 pozzetti di fette embrioni. 2. Chick Embryo Preparazione Luogo fecondati uova di gallina con il lato più lungo in orizzontale in un tiraggio forzato incubatore a 38 ° C fino a quando si sviluppano in scena 15 24. Questo richiede di solito circa 4 giorni di incubazione. Il secondo giorno di incubazione, sterilizzare il guscio dell'uovo strofinando con un fazzolettino di carta imbevuto di etanolo al 70%. Attentamente forare l'estremità piatta del guscio dell'uovo utilizzando un ago da 21 attaccato ad una siringa da 5 ml e rimuovere 5 ml di albumina. Questo riduce l'embrione di distanza dalla shell, quindi l'embrione non è danneggiata quando il serbatoio è aperto. Riportare le uova per l'incubatore e incubare loro per altri 2 giorni. Utilizzando smussato Dumont # 5 pinze carefully forare il centro della parte superiore del guscio e rimuovere circa 9 cm 2 di shell. Tagliare intorno l'embrione e con attenzione sollevare l'embrione e il luogo in HBSS durante la dissezione. Gli embrioni devono essere messo in scena in base alle Hamburger e Hamilton (1992) 15. Tutti gli embrioni utilizzati dovrebbe essere vicino alla fase 24. Eventuali embrioni che mostrano segni di anomalia deve essere eliminata. Rimuovere la membrana amniotica, corio-allantoico membrana, la testa, e allantoide con due Dumont # 5 forcipe. Eviscerate l'embrione per rimuovere tutti gli organi interni. Per effettuare questa operazione, tagliare aprire la linea mediana ventrale dell'embrione con micro forbici dissezione, tenere l'embrione attorno alla regione del tronco rostrale con un paio di pinze, afferrare la parte rostrale del intestino e il cuore e tirare caudalmente. È importante che questo è fatto pulito. Si dovrebbe essere in grado di vedere l'embrione somiti chiaramente. Tagliare l'embrione a metà, trasversalmente tra il buds.Now arto superiore e inferiore tagliare il corpo toracicaparete con le forbici microdissezione. 3. Embrione Slice Preparazione Rimuovere la soluzione di agarosio dal bagnomaria. Tagliare 5 cm dal fondo di una plastica monouso 3 ml pipetta Pasteur. Rimuovere delicatamente la parte lombare della dell'embrione sezionato con due pinze per cullare l'embrione dalla soluzione dissezione e mettere in un piatto asciutto Petri. Utilizzando la pipetta Pasteur, rimuovere circa 2 ml di agarosio, pipetta circa 0,5 ml sopra dell'embrione e quindi aspirare la fetta embrione nella pipetta. Trasferire l'embrione e agarosio ad una buccia di distanza stampo di plastica fare attenzione a non introdurre bolle nel agarosio. Abbassare delicatamente l'embrione al fondo del agarosio nello stampo di plastica con la sezione toracica rivolto verso il basso. L'embrione deve essere posizionata per essere direttamente utilizzando un ago calibro 21. Le fette conterrà anche parte dell'arto sviluppo ed è importante che l'orientamento dell'embrione in agarose lo consentiranno. Collocare l'imbarcazione su ghiaccio per impostare l'agarosio. Fare attenzione che l'embrione non cambia l'orientamento in questo periodo (circa 2 min). La Leica VT1000S vibratomo (Velocità 3, frequenza 4, 400 micron di spessore fette) deve essere istituito con la camera piena di HBSS affettare e circondato da acqua ghiacciata. Il blocco di agarosio viene quindi attaccato alla piattaforma vibratomo con colla super. Il blocco di agarosio viene tagliato con una lama di rasoio per lasciare il pezzo embrione con 1-3 mm di agarosio circonda. Le fette che includono sezioni gemma degli arti con una chiara apicale ectodermica Rigde vengono selezionati e queste fette vengono poi poste in HBSS. Generalmente, ci sono solo 1-2 fette adatti per embrione. Rimuovere delicatamente l'agarosio intorno alle fette di tessuto con due aghi. È essenziale che questo è fatto accuratamente. 4. Coltura embrioni Fette Aggiungere 500 ml di soluzione di coltura (di cui sopra) al required il numero di pozzetti di una 24 pozzetti bassissimo piastra di fissaggio del tessuto trattato della cultura. Trasferire le fette attentamente dalla soluzione HBSS nel pozzo. In generale, cerchiamo di avere due o tre fette in ciascun pozzetto. Posizionare la piastra a 24 pozzetti in coltura tissutale incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 per 24 ore. 5. Sezionamento delle slice per i Immunostaining A seguito del periodo di coltura, aggiungere 500 microlitri di correzione unbuffered a ciascun pozzetto di fette embrioni e lasciare in ghiaccio per 20 min. La soluzione totale viene poi rimosso con attenzione e tre lavaggi PBS sono effettuate, con intervalli di 5 minuti. Le fette vengono poi lasciati in soluzione di saccarosio a 4 ° C, fino al lavello fette, circa 6 ore, ma può essere lasciato a lungo (ad esempio durante la notte). Togliere le fette e tamponare una soluzione di saccarosio in più ed equilibrare in circa 1 ml di ottobre per circa 5 minuti a 20 ° C. Montare ogni appartamento fetta in un PTOM pieno di staccarsi stampi in plastica.Dopo il montaggio, mettere gli stampi in verticale su ghiaccio secco a solidificare. Montare i blocchi ottobre nel criostato ed equilibrare i blocchi a -24 ° C per circa 20 min. Tagliare ogni fetta con 15 sezioni mm montato su Superfrost-Plus diapositive. Vetrini possono essere conservati a -80 ° C fino al loro utilizzo. 6. Immunofluorescenza Pipettare 1-2 ml di PBS sulle slitte orizzontali tenuti in una camera umidificata con le slitte sollevate dal fondo della camera (usiamo 1 o 2 ml pipette di plastica fissati con nastro autoclave). Incubare le sezioni in PBS per 5 min a 20 ° C per rimuovere l'eccesso ottobre Rimuovere la soluzione PBS dal vetrino e aggiungere 500 ml di soluzione di blocco sulle sezioni, incubare per 30 min a 20 ° C. Rimuovere la soluzione di blocco e immediatamente aggiungere 500 ml di anticorpo primario diluito aggiunto ai vetrini, incubare a 4 ° C per 18-22 ore. Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi e subito è statoh i vetrini con 1 ml di PBS per 5 minuti, tre volte a 20 ° C per rimuovere l'eccesso di soluzione di anticorpo primario. Aggiungere 500 ml di soluzione diluita di anticorpo secondario fra le diverse sezioni. I vetrini vengono quindi lasciati a 20 ° C per 30 min. La soluzione di anticorpo secondario viene quindi rimosso e la slitta lavata 3 volte 5 min in PBS a 20 ° C. A seguito di queste soluzioni di lavaggio, rimuovere la finale PBS lavaggio, tamponare il bordo della diapositiva per rimuovere l'eccesso di PBS, aggiungere due gocce di Vectashield sulle slitte e appoggiare delicatamente un coprioggetto di vetro sopra le sezioni, evitando la formazione di bolle. Rimuovere Vectashield eccesso tamponando dal bordo delle diapositive prima di imaging. 7. Imaging Immagine le sezioni immunocolorate. Usiamo un Nikon Eclipse E80i microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera digitale ORCA Hamammatsu ER e 10 X, 40 X 20X e lenti degli obbiettivi.