Yeni Araçlar HIV-1 ile enfekte bireyler gelen Düzenleyici T hücreleri büyütmek için
Summary
CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.
Abstract
CD4 + Düzenleyici T hücreleri (Tregs) güçlü bağışıklık modülatörleri ve insan bağışıklık dengesinin sağlanmasında önemli bir işlev görürler. Tregs tükenmesi kanser ve bulaşıcı patojen için aşı ortamlarda antijen-spesifik T hücre yanıtları ölçülebilir artışlara yol açmıştır. Ya da zararlı bir HIV-1 ile ilişkili immün aktivasyon bastırmak için vermektedir ve bu nedenle, HIV-1 hastalığın ilerlemesini yavaşlatmak ya da alternatif olarak, HIV-1 spesifik bağışıklık bastırmak ve böylece virüs teşvik olabilir Ancak, HİV-1 imüno-patogenezinde rol, tartışmalıdır yayıldı. Anlama ve HIV-1 bağlamında modüle Treg fonksiyonu immünoterapi veya HIV aşılar için potansiyel yeni stratejiler yol açabilir. Ancak, önemli açık sorular dikkatle incelenmesi gereken HIV-1 enfeksiyonu, bağlamında rolleri kalır.
Treg popülasyonunda inceleyerek, insan CD4 + periferal kan T-hücrelerinin yaklaşık% 5'ini temsil eden ES zor olduğu kanıtlanmıştırpecially HIV-1 ile ilişkili bir CD4 T hücresi HIV-1 ile enfekte olmuş kişilerde ve ile bu Treg tükenmesi oluşur. İleri HIV-1 hastalığı veya doku örnekleri, sadece çok küçük bir biyolojik numune elde edilebileceği için, bu nedenle son derece zorlu olan bireylerde, düzenleyici T hücrelerinin karakterizasyonu. Biz HIV-1 pozitif bireylerin Tregs izolasyonu ve genişleme kullanarak bu sınırlamaları aşmak için teknik bir çözüm öneriyoruz.
Burada başarılı bir şekilde in vitro HIV-1 ile enfekte bireylerden Tregs izole genişletmek için kolay ve sağlam bir yöntem açıklanmaktadır. Akış kriteri CD3 + CD4 + CD25 + CD127 düşük Tregs anti-CD3/anti-CD28 ile kaplı boncuklar ile uyarılır ve IL-2 varlığında kültürlendi. Genişletilmiş Tregs FOXP3, yüksek düzeyde ifade edilir ve CTLA4 HELİOS geleneksel T-hücreleri ile karşılaştırıldığında ve son derece baskılayıcı olduğu gösterilmiştir. Tregs çok sayıda daha kolay erişim araştırmacılar i ele sağlayacakHIV-1 immünopatogenezinde rolleri ile ilgili mportant sorular. Biz bu sorulara cevap etkili bir HIV-1 aşısının geliştirilmesi için yararlı bilgiler sağlayabilir inanıyorum.
Introduction
Dünyada HIV / AIDS ve yeni 2011 yılında enfekte yaklaşık 2,5 milyon kişi, dünya çapında HIV salgını engellemek için etkili bir HIV aşısı için ihtiyacı ile yaşayan fazla 34 milyon kişi ile her şeyden kalır. Ancak, yoğun araştırma çabalarının üç yıl olmasına rağmen, bugüne kadar HIV-1 aşı etkinliği çalışmalarda sadece mütevazı koruma 1-3 sonuçlandı ve koruyucu bağışıklık karşılıklarını tam olarak anlaşılamamıştır kalır. Koruma için gerekli bağışıklık tepkisinin doğasını açıklık bir HIV-1 aşı ve HIV-1 enfeksiyonu hedef alan diğer immünoterapötik stratejilerinin stratejik tasarımı için gereklidir.
Doğal CD4 + düzenleyici T hücreleri (Tregs) dolayısıyla immün-aracılı doku hasarı sınırlama, aşırı immün aktivasyon kontrol ederek bağışıklık hücre homeostazının bakım için kritik öneme sahiptir. Ancak, onlar da patojenlere karşı bağışıklık yanıtlarını bastırmak ve boşluk önleyebilir. Kanser ve HEPAtitis B aşısı çalışmaları Tregs aktivitesini azaltarak aşı yanıtı ve virüslere karşı 4-7 antijen-spesifik bağışıklık geliştirmek olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, HIV-1 enfeksiyonu bağlamında, düzenleyici T hücrelerinin tam etkisini tam olarak anlaşılamamıştır. Tregs aktive edilmiş T hücreleri 8'de virüs replikasyonu azaltmak ve muhtemelen immün sistemin 9 etkisi gösterilmiştir. Ayrıca, hastalık ilerlemesi 10,11 olumsuz sonuçlara sahip olabilir, HIV-1 spesifik bağışıklık tepkileri, bastırmak için gösterilmiştir. Bu nedenle, HIV-1 aşı etkinliğini artırmak için Treg aktivitesini modüle etmek mümkün edilmeden önce, bu hastalığın bağlamda fonksiyonu içine daha fazla fikir edinmek için önemlidir.
İnsan CD4 + regülatör T hücreleri, yaklaşık 5 CD4 +% periferal kan T-hücrelerinde ve daha da kesin sayıları HIV ile ilişkili CD4 + T hücre tükenmesi 12 ile azalma temsil eden, nispeten az bir hücre popülasyonu olarak </> Sup. Ko-kültür Treg ile böyle T hücresi çoğalma tahlilleri gibi Treg fonksiyonu değerlendirmek Mevcut analizler, göreceli olarak büyük bir hücre sayıları 12 kullanımı. Bu nedenle, gelişmiş olan kişilerde düzenleyici T hücrelerinin fonksiyon ve özgüllük karakterize HIV-1 hastalığı HIV patogenezinde önemi rağmen, zorlu olmuştur.
HIV-1 hastalardan Tregs ex vivo izolasyonu ve genişleme bu sınırlamaları bazılarının üstesinden gelmek için bir çözüm temsil edebilir. Burada in vitro HIV-1 ile enfekte bireyler elde edilen fonksiyonel Tregs genişletmek için kolay ve güçlü bir protokol açıklar, biz daha fazla nasıl fenotip onlara açıklamak ve akım sitometrik deneyleri kullanarak baskılayıcı fonksiyonunu test edin. Biz bu protokolü Tregs erişimi kolaylaştırmak ve HIV-1 hastalığın ilerlemesine rolleri anlamak yardımcı olacağına inanıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Using the protocol described above, Tregs can be successfully isolated and expanded from HIV-1-infected individuals in vitro. Expanded Tregs express high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS, are highly suppressive and display a highly demethylated Treg-Specific Demethylation Region (TSDR) locus of the FOXP3 gene (data not shown) 15, suggesting true origin from the regulatory T cell lineage, as opposed to activation-induced transient FOXP3 upregulation. Deep sequencing demonstrated that the TCR repertoir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by research funding from the Elisabeth Glaser Pediatric AIDS Foundation (Pediatric HIV Vaccine Program Award MV-00-9-900-1429-0-00 to MMA), MGH/ECOR (Physician Scientist Development Award to MMA), NIH NIAID (KO8219 AI074405 and AI074405-03S1 to MMA), and the Harvard University Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI060354) which is supported by the following NIH Co-Funding and Participating Institutes and Centers: NIAID, NCI, NICHD, NHLBI, NIDA, NIMH, NIA, FIC, and OAR. These studies were furthermore supported by the Bill & Melinda Gates Foundation and the Terry and Susan Ragon Foundation.
Materials
| Reagents | |||
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | Stemcells technologies | 15062 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Histopaque | Sigma | H8889 | |
| Anti-CD3-PECy7 | BD Pharmingen | 557851 | |
| Anti-CD4-FITC | eBioscience | 11-0049-42 | |
| Anti-CD25-APC | eBioscience | 17-0259-42 | |
| Anti-CD127-PE | BD Pharmingen | 557938 | |
| Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh | BD Falcon | 352235 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-001-Cl | |
| Human Serum | Gemini Bio-Products | 100-512 | |
| Human T-activator CD3/CD28 | Life Technologies | 111.31D | |
| IL-2 | NIH Aids Research & Reference Reagent Program | 136 | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L34955 | |
| Anti-CD4-qdot-655 | Life Technologies | Q10007 | |
| Anti-CD25-PECy5 | eBiosciences | 15-0259-42 | |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBiosciences | 00-5523-00 | |
| Anti-FOXP3-PE | eBiosciences | 12-4776-42 | |
| Anti-HELIOS-FITC | Biolegend | 137204 | |
| Anti-CTLA4-APC | BD Pharmingen | 555855 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C34557 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Life Technologies | V12883 | |
| HEPES | Mediatech | 25-060-Cl | |
| Treg Suppression inspector | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Anti-CD4-APC | BD Pharmingen | 340443 | |
| Anti-CD8-AF700 | BD Pharmingen | 557945 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Glutamine | Mediatech | 25-002-Cl | |
| Materials | |||
| BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364606 | |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | – | |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | – | |
| FlowJo | Tree Star | v887 |
References
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Buchbinder, S. P., et al. Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the Step Study): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concept trial. Lancet. 372 (08), 1881-1893 (2008).
- Pitisuttithum, P., et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled efficacy trial of a bivalent recombinant glycoprotein 120 HIV-1 vaccine among injection drug users in Bangkok, Thailand. J. Infect. Dis. 194, 1661-1671 (2006).
- Morse, M. A., et al. Depletion of human regulatory T cells specifically enhances antigen-specific immune responses to cancer vaccines. Blood. 112, 610-618 (2008).
- Furuichi, Y., et al. Depletion of CD25+CD4+T cells (Tregs) enhances the HBV-specific CD8+ T cell response primed by DNA immunization. World J. Gastroenterol. 11, 3772-3777 (2005).
- Rech, A. J., Vonderheide, R. H. Clinical use of anti-CD25 antibody daclizumab to enhance immune responses to tumor antigen vaccination by targeting regulatory T cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1174, 99-106 (2009).
- Ruter, J., et al. Altering regulatory T cell function in cancer immunotherapy: a novel means to boost the efficacy of cancer vaccines. Front Biosci. 14, 1761-1770 (2009).
- Moreno-Fernandez, M. E., Rueda, C. M., Rusie, L. K., Chougnet, C. A. Regulatory T cells control HIV replication in activated T cells through a cAMP-dependent mechanism. Blood. 117, 5372-5380 (2011).
- Schulze Zur Wiesch, J., et al. Comprehensive analysis of frequency and phenotype of T regulatory cells in HIV infection: CD39 expression of FoxP3+ T regulatory cells correlates with progressive disease. J. Virol. 85, 1287-1297 (2011).
- Kinter, A., et al. Suppression of HIV-specific T cell activity by lymph node CD25+ regulatory T cells from HIV-infected individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3390-3395 (2007).
- Moreno-Fernandez, M. E., Presicce, P., Chougnet, C. A. Homeostasis and function of regulatory T cells in HIV/SIV infection. J. Virol. , (2012).
- Angin, M., et al. Preserved Function of Regulatory T Cells in Chronic HIV-1 Infection Despite Decreased Numbers in Blood and Tissue. J. Infect. Dis. 205, 1495-1500 (2012).
- Seddiki, N., et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med. 203, 1693-1700 (2006).
- De Jager, P. L., et al. The role of the CD58 locus in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 5264-5269 (2009).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
- Salomon, B., et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity. 12, 431-440 (2000).
- Malek, T. R., Bayer, A. L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nat. Rev. Immunol. 4, 665-674 (2004).
- Hoffmann, P., Eder, R., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Edinger, M. Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4(+)CD25high regulatory T cells. Blood. 104, 895-903 (2004).
- Putnam, A. L., et al. Expansion of human regulatory T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes. 58, 652-662 (2009).
- Kreijveld, E., Koenen, H. J., Hilbrands, L. B., Joosten, I. Ex vivo expansion of human CD4+ CD25high regulatory T cells from transplant recipients permits functional analysis of small blood samples. J. Immunol. Methods. 314, 103-113 (2006).
- Ebinuma, H., et al. Identification and in vitro expansion of functional antigen-specific CD25+ FoxP3+ regulatory T cells in hepatitis C virus infection. J Virol. 82, 5043-5053 (2008).
- Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS ONE. 4, e5994 (2009).
- Heredia, A., et al. Rapamycin causes down-regulation of CCR5 and accumulation of anti-HIV beta-chemokines: an approach to suppress R5 strains of HIV-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10411-10416 (1073).
- Hoffmann, P., et al. Only the CD45RA+ subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T-cell lines upon in vitro expansion. Blood. 108, 4260-4267 (2006).
- Hoffmann, P., et al. Loss of FOXP3 expression in natural human CD4+CD25+ regulatory T cells upon repetitive in vitro stimulation. Eur. J. Immunol. 39, 1088-1097 (2009).
- Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J. Exp. Med. 192, 303-310 (2000).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. J. Immunol. 184, 3433-3441 (2010).
- Zheng, S. G., Gray, J. D., Ohtsuka, K., Yamagiwa, S., Horwitz, D. A. Generation ex vivo of TGF-beta-producing regulatory T cells from CD4+CD25- precursors. J. Immunol. 169, 4183-4189 (2002).
- Gregori, S., Roncarolo, M. G., Bacchetta, R. Methods for in vitro generation of human type 1 regulatory T cells. Methods Mol. Biol. 677, 31-46 (2011).
