Новые методы для расширения регуляторных Т-клеток от ВИЧ-1-инфицированных
Summary
CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.
Abstract
CD4 + регуляторных Т-клеток (Tregs) являются мощными иммуномодуляторами и играют важную функцию в человеческом иммунного гомеостаза. Истощение Tregs привело к заметному увеличению антиген-специфических Т-клеточные ответы на вакцину настройки для рака и инфекционных возбудителей. Тем не менее, их роль в ВИЧ-1 иммуно-патогенеза остается спорным, так как они могут служить либо для подавления вредных ВИЧ-1 связанных иммунную активацию и тем самым замедлить ВИЧ-1 прогрессирования заболевания или же подавлять ВИЧ-1-специфический иммунитет и тем самым стимулировать вируса распространяться. Понимание и модулирующей функции Treg в контексте ВИЧ-1 может привести к потенциальным новым стратегиям для иммунотерапии или вакцин против ВИЧ. Тем не менее, важные вопросы остаются открытыми на их роль в контексте ВИЧ-1 инфекции, которая должна быть тщательно изучена.
Представляя примерно 5% от человеческих CD4 + Т-клеток в периферической крови, изучая Treg населения оказалось трудно, ESглавным образом у ВИЧ-1-инфицированных, где ВИЧ-1-связанного CD4 Т-клеток и с этим происходит истощение Treg. Характеристика регуляторных Т-клеток у пациентов с продвинутой стадией ВИЧ-1 заболевания или тканей, для которых только очень малые биологические образцы могут быть получены, поэтому чрезвычайно сложной задачей. Мы предлагаем технические решения для преодоления этих ограничений использованием изоляции и расширения Tregs от ВИЧ-1-инфицированных.
Здесь мы опишем простой и надежный метод успешно расширять Tregs изолированы от ВИЧ-1-инфицированных в пробирке. Поток отсортированных CD3 + CD4 + CD25 + CD127 низкий Tregs были стимулированы anti-CD3/anti-CD28 покрытые гранулы и культивировали в присутствии ИЛ-2. Расширенное Tregs выразили высокие уровни FOXP3, CTLA4 и ГЕЛИОС по сравнению с обычным Т-клетки и были показаны весьма подавляющим. Более легкий доступ к большому количеству Tregs позволит исследователям адрес, который яmportant вопросы, касающиеся их роли в ВИЧ-1 иммунопатогенеза. Мы считаем, что ответы на эти вопросы опыт может оказаться полезным для развития эффективной профилактики ВИЧ-1 вакцины.
Introduction
Обладая более чем 34 миллионов людей, живущих с ВИЧ / СПИДом во всем мире и, по оценкам, 2,5 миллиона человек были впервые инфицированы в 2011 году потребность в эффективной вакцины против ВИЧ, чтобы обуздать всемирную эпидемию ВИЧ остается первостепенной. Однако, несмотря на три десятилетия интенсивных научных исследований, ВИЧ-1 испытаний эффективность вакцины на сегодняшний день привели лишь скромные защиту 1-3 и коррелирует защитного иммунитета остаются плохо изученными. Выяснения природы иммунного ответа, необходимые для защиты имеет важное значение для стратегической разработки эффективного ВИЧ-1 вакцины и другие иммунотерапевтическую стратегий, нацеленных на ВИЧ-1 инфекции.
Природные CD4 + регуляторных Т-клеток (Tregs) имеют решающее значение для поддержания иммунного гомеостаза клетки, контролируя чрезмерную иммунную активацию, тем самым ограничивая иммуноопосредованной повреждению тканей. Однако они также могут подавлять иммунный ответ против патогенов и предотвратить их очистку. Рака и Hepaисследования гепатита B вакцины продемонстрировали, что снижение активности Tregs может улучшить отклик вакцины и антиген-специфический иммунитет против вирусов 4-7. Тем не менее, в контексте ВИЧ-1 инфекции, точным ударом регуляторных Т-клеток остаются не вполне ясными. Tregs было показано, что снижение репликации вируса в активированных Т-клетках 8 и, возможно, повлиять иммунной активации 9. Они были также показаны для подавления ВИЧ-1-специфических иммунных реакций, что может иметь негативные последствия для прогрессирования заболевания 10,11. Таким образом, прежде чем он сможет модулировать активность Treg для повышения эффективности ВИЧ-1 вакцины, важно, чтобы получить дальнейшее понимание их функции в контексте данного заболевания.
Человеческих CD4 + регуляторные Т-клетки относительно редким популяцией клеток, что составляет около 5% от CD4 + Т-клеток в периферической крови, а их абсолютные цифры дальнейшее снижение с ВИЧ-ассоциированной CD4 + Т-лимфоцитов 12 </ Вир>. Текущие анализы для оценки Treg функции, такой как анализы пролиферации Т-клеток с Treg совместного культивирования, использование относительно большого количества клеток 12. Таким образом, характеризующей функции и специфичности регуляторных Т-клеток у пациентов с поздними стадиями ВИЧ-1 заболевания была сложной, несмотря на их важность для патогенеза ВИЧ.
Бывший изоляции естественных и расширение Tregs из ВИЧ-1 пациентов может представлять собой решение для преодоления некоторых из этих ограничений. Здесь мы опишем простой и надежный протокол расширить функциональные Tregs, взятых у ВИЧ-1-инфицированных лиц в пробирке, мы более подробно объяснить, как фенотип их и проверить их подавляющих функцию с помощью проточной цитометрии анализа. Мы считаем, что этот протокол будет способствовать доступу к Tregs и помощь в понимании их роли в ВИЧ-1 прогрессирования заболевания.
Protocol
Representative Results
Discussion
Using the protocol described above, Tregs can be successfully isolated and expanded from HIV-1-infected individuals in vitro. Expanded Tregs express high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS, are highly suppressive and display a highly demethylated Treg-Specific Demethylation Region (TSDR) locus of the FOXP3 gene (data not shown) 15, suggesting true origin from the regulatory T cell lineage, as opposed to activation-induced transient FOXP3 upregulation. Deep sequencing demonstrated that the TCR repertoir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by research funding from the Elisabeth Glaser Pediatric AIDS Foundation (Pediatric HIV Vaccine Program Award MV-00-9-900-1429-0-00 to MMA), MGH/ECOR (Physician Scientist Development Award to MMA), NIH NIAID (KO8219 AI074405 and AI074405-03S1 to MMA), and the Harvard University Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI060354) which is supported by the following NIH Co-Funding and Participating Institutes and Centers: NIAID, NCI, NICHD, NHLBI, NIDA, NIMH, NIA, FIC, and OAR. These studies were furthermore supported by the Bill & Melinda Gates Foundation and the Terry and Susan Ragon Foundation.
Materials
| Reagents | |||
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | Stemcells technologies | 15062 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Histopaque | Sigma | H8889 | |
| Anti-CD3-PECy7 | BD Pharmingen | 557851 | |
| Anti-CD4-FITC | eBioscience | 11-0049-42 | |
| Anti-CD25-APC | eBioscience | 17-0259-42 | |
| Anti-CD127-PE | BD Pharmingen | 557938 | |
| Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh | BD Falcon | 352235 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-001-Cl | |
| Human Serum | Gemini Bio-Products | 100-512 | |
| Human T-activator CD3/CD28 | Life Technologies | 111.31D | |
| IL-2 | NIH Aids Research & Reference Reagent Program | 136 | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L34955 | |
| Anti-CD4-qdot-655 | Life Technologies | Q10007 | |
| Anti-CD25-PECy5 | eBiosciences | 15-0259-42 | |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBiosciences | 00-5523-00 | |
| Anti-FOXP3-PE | eBiosciences | 12-4776-42 | |
| Anti-HELIOS-FITC | Biolegend | 137204 | |
| Anti-CTLA4-APC | BD Pharmingen | 555855 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C34557 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Life Technologies | V12883 | |
| HEPES | Mediatech | 25-060-Cl | |
| Treg Suppression inspector | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Anti-CD4-APC | BD Pharmingen | 340443 | |
| Anti-CD8-AF700 | BD Pharmingen | 557945 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Glutamine | Mediatech | 25-002-Cl | |
| Materials | |||
| BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364606 | |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | – | |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | – | |
| FlowJo | Tree Star | v887 |
References
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Buchbinder, S. P., et al. Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the Step Study): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concept trial. Lancet. 372 (08), 1881-1893 (2008).
- Pitisuttithum, P., et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled efficacy trial of a bivalent recombinant glycoprotein 120 HIV-1 vaccine among injection drug users in Bangkok, Thailand. J. Infect. Dis. 194, 1661-1671 (2006).
- Morse, M. A., et al. Depletion of human regulatory T cells specifically enhances antigen-specific immune responses to cancer vaccines. Blood. 112, 610-618 (2008).
- Furuichi, Y., et al. Depletion of CD25+CD4+T cells (Tregs) enhances the HBV-specific CD8+ T cell response primed by DNA immunization. World J. Gastroenterol. 11, 3772-3777 (2005).
- Rech, A. J., Vonderheide, R. H. Clinical use of anti-CD25 antibody daclizumab to enhance immune responses to tumor antigen vaccination by targeting regulatory T cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1174, 99-106 (2009).
- Ruter, J., et al. Altering regulatory T cell function in cancer immunotherapy: a novel means to boost the efficacy of cancer vaccines. Front Biosci. 14, 1761-1770 (2009).
- Moreno-Fernandez, M. E., Rueda, C. M., Rusie, L. K., Chougnet, C. A. Regulatory T cells control HIV replication in activated T cells through a cAMP-dependent mechanism. Blood. 117, 5372-5380 (2011).
- Schulze Zur Wiesch, J., et al. Comprehensive analysis of frequency and phenotype of T regulatory cells in HIV infection: CD39 expression of FoxP3+ T regulatory cells correlates with progressive disease. J. Virol. 85, 1287-1297 (2011).
- Kinter, A., et al. Suppression of HIV-specific T cell activity by lymph node CD25+ regulatory T cells from HIV-infected individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3390-3395 (2007).
- Moreno-Fernandez, M. E., Presicce, P., Chougnet, C. A. Homeostasis and function of regulatory T cells in HIV/SIV infection. J. Virol. , (2012).
- Angin, M., et al. Preserved Function of Regulatory T Cells in Chronic HIV-1 Infection Despite Decreased Numbers in Blood and Tissue. J. Infect. Dis. 205, 1495-1500 (2012).
- Seddiki, N., et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med. 203, 1693-1700 (2006).
- De Jager, P. L., et al. The role of the CD58 locus in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 5264-5269 (2009).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
- Salomon, B., et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity. 12, 431-440 (2000).
- Malek, T. R., Bayer, A. L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nat. Rev. Immunol. 4, 665-674 (2004).
- Hoffmann, P., Eder, R., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Edinger, M. Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4(+)CD25high regulatory T cells. Blood. 104, 895-903 (2004).
- Putnam, A. L., et al. Expansion of human regulatory T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes. 58, 652-662 (2009).
- Kreijveld, E., Koenen, H. J., Hilbrands, L. B., Joosten, I. Ex vivo expansion of human CD4+ CD25high regulatory T cells from transplant recipients permits functional analysis of small blood samples. J. Immunol. Methods. 314, 103-113 (2006).
- Ebinuma, H., et al. Identification and in vitro expansion of functional antigen-specific CD25+ FoxP3+ regulatory T cells in hepatitis C virus infection. J Virol. 82, 5043-5053 (2008).
- Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS ONE. 4, e5994 (2009).
- Heredia, A., et al. Rapamycin causes down-regulation of CCR5 and accumulation of anti-HIV beta-chemokines: an approach to suppress R5 strains of HIV-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10411-10416 (1073).
- Hoffmann, P., et al. Only the CD45RA+ subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T-cell lines upon in vitro expansion. Blood. 108, 4260-4267 (2006).
- Hoffmann, P., et al. Loss of FOXP3 expression in natural human CD4+CD25+ regulatory T cells upon repetitive in vitro stimulation. Eur. J. Immunol. 39, 1088-1097 (2009).
- Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J. Exp. Med. 192, 303-310 (2000).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. J. Immunol. 184, 3433-3441 (2010).
- Zheng, S. G., Gray, J. D., Ohtsuka, K., Yamagiwa, S., Horwitz, D. A. Generation ex vivo of TGF-beta-producing regulatory T cells from CD4+CD25- precursors. J. Immunol. 169, 4183-4189 (2002).
- Gregori, S., Roncarolo, M. G., Bacchetta, R. Methods for in vitro generation of human type 1 regulatory T cells. Methods Mol. Biol. 677, 31-46 (2011).
