Nuovi strumenti per espandere cellule T regolatorie di individui HIV-1-infetti
Summary
CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.
Abstract
CD4 + cellule T regolatorie (Treg) sono potenti modulatori immunitari e servono una funzione importante nella omeostasi immunitaria umana. L'esaurimento delle Tregs ha determinato aumenti misurabili in antigene-specifiche risposte delle cellule T nelle impostazioni del vaccino per il cancro e gli agenti patogeni infettivi. Tuttavia, il loro ruolo in HIV-1 immuno-patogenesi rimane controversa, in quanto potrebbero servire sia per sopprimere deleteria attivazione immunitaria HIV-1-associata e quindi rallentare la progressione della malattia da HIV-1 o in alternativa sopprimere l'immunità HIV-1-specifica e, quindi, promuovere virus diffondersi. La comprensione e la funzione Treg modulando nel contesto di HIV-1 potrebbero portare a potenziali nuove strategie di immunoterapia o vaccini contro l'HIV. Tuttavia, importanti questioni aperte rimangono sul loro ruolo nel contesto di HIV-1, che deve essere studiato con attenzione.
Rappresentando circa il 5% di CD4 + cellule T nel sangue periferico, studiando la popolazione Treg è dimostrato difficile, esspecialmente in HIV-1 individui infetti in cui l'HIV-1-associati delle cellule T CD4 e si verifica che la deplezione Treg. La caratterizzazione delle cellule T regolatorie in individui con HIV in fase avanzata-1 malattia o campioni di tessuto, per cui solo molto piccoli campioni biologici possono essere ottenuti, è quindi estremamente impegnativo. Noi proponiamo una soluzione tecnica per superare queste limitazioni utilizzando l'isolamento e l'espansione delle Treg da individui HIV-1-positivi.
Qui si descrive un metodo semplice e affidabile per espandere con successo Treg isolate da individui HIV-1-infetti in vitro. Flow-sorted CD3 + CD4 + CD25 + CD127 partire Tregs state stimolate con anti-CD3/anti-CD28 perline rivestite e coltivate in presenza di IL-2. L'espanso Treg espresso alti livelli di FOXP3, CTLA4 e HELIOS rispetto alle cellule T convenzionali e risultano essere molto soppressiva. Più facile l'accesso a un gran numero di Treg permetterà ai ricercatori di affrontare importante domande riguardanti il loro ruolo in HIV-1 immunopatogenesi. Crediamo rispondere a queste domande può fornire indicazioni utili per lo sviluppo di un efficace vaccino HIV-1.
Introduction
Con più di 34 milioni di persone che vivono con l'HIV / AIDS in tutto il mondo e si stima che 2,5 milioni di persone recentemente infettate nel 2011, la necessità di un efficace vaccino HIV per frenare l'epidemia di HIV in tutto il mondo rimane fondamentale. Tuttavia, nonostante tre decenni di intensi sforzi di ricerca, gli HIV-1 vaccino prove di efficacia fino ad oggi hanno portato solo una protezione modesta 1-3 ed i correlati di protezione immunitaria sono ancora limitate. Delucidare la natura della risposta immunitaria necessaria per la protezione è essenziale per la progettazione strategica di un efficace vaccino HIV-1 e di altre strategie immunoterapeutiche di targeting HIV-1.
CD4 Naturali + cellule T regolatorie (Treg) sono fondamentali per il mantenimento dell'omeostasi delle cellule immunitarie attraverso il controllo attivazione immunitaria eccessiva, limitando così i danni ai tessuti immuno-mediata. Tuttavia, possono anche sopprimere le risposte immunitarie contro gli agenti patogeni e prevenire la loro liquidazione. Cancro e Hepatitis studi vaccino B hanno dimostrato che diminuendo l'attività di Treg può migliorare la risposta al vaccino e antigene-specifica immunità contro i virus 4-7. Tuttavia, nel contesto di infezione da HIV-1, l'esatto impatto delle cellule T regolatorie rimane completamente compresa. Tregs hanno mostrato di diminuire la replicazione virale in cellule T attivate 8 ed eventualmente urtare attivazione immunitaria 9. Sono stati anche dimostrato di sopprimere le risposte immunitarie HIV-1-specifiche, che potrebbe avere conseguenze negative per la progressione della malattia 10,11. Così, prima di poter modulare l'attività Treg per migliorare l'efficacia di un vaccino di HIV-1, è importante ottenere una visione più la loro funzione in questo contesto malattia.
CD4 + umane cellule T regolatorie sono una popolazione di cellule relativamente scarsa, che rappresentano circa il 5% delle cellule T CD4 + nel sangue periferico, e il loro numero assoluto ulteriore diminuzione con CD4 HIV-associati + T deplezione delle cellule 12 </ Sup>. Saggi attuali per valutare la funzione Treg, come ad esempio T saggi di proliferazione delle cellule Treg con co-coltura, utilizzare il numero di cellule relativamente grandi 12. Pertanto, la funzione e la specificità delle cellule T regolatorie che caratterizza in persone con HIV in stadio avanzato 1 malattia è stato impegnativo, nonostante la loro importanza per la patogenesi dell'HIV.
L'isolamento e l'espansione ex vivo di Treg da HIV-1 i pazienti potrebbero rappresentare una soluzione per superare alcune di queste limitazioni. Qui si descrive un protocollo semplice e robusto per espandere Treg funzionale derivato da HIV-1 individui infettati in vitro, abbiamo ulteriormente spieghiamo come loro fenotipo e testare la loro funzione soppressiva utilizzando saggi di citometria a flusso. Crediamo che questo protocollo faciliterà l'accesso al Treg e di aiuto per capire il loro ruolo in HIV-1 la progressione della malattia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Using the protocol described above, Tregs can be successfully isolated and expanded from HIV-1-infected individuals in vitro. Expanded Tregs express high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS, are highly suppressive and display a highly demethylated Treg-Specific Demethylation Region (TSDR) locus of the FOXP3 gene (data not shown) 15, suggesting true origin from the regulatory T cell lineage, as opposed to activation-induced transient FOXP3 upregulation. Deep sequencing demonstrated that the TCR repertoir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by research funding from the Elisabeth Glaser Pediatric AIDS Foundation (Pediatric HIV Vaccine Program Award MV-00-9-900-1429-0-00 to MMA), MGH/ECOR (Physician Scientist Development Award to MMA), NIH NIAID (KO8219 AI074405 and AI074405-03S1 to MMA), and the Harvard University Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI060354) which is supported by the following NIH Co-Funding and Participating Institutes and Centers: NIAID, NCI, NICHD, NHLBI, NIDA, NIMH, NIA, FIC, and OAR. These studies were furthermore supported by the Bill & Melinda Gates Foundation and the Terry and Susan Ragon Foundation.
Materials
| Reagents | |||
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | Stemcells technologies | 15062 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Histopaque | Sigma | H8889 | |
| Anti-CD3-PECy7 | BD Pharmingen | 557851 | |
| Anti-CD4-FITC | eBioscience | 11-0049-42 | |
| Anti-CD25-APC | eBioscience | 17-0259-42 | |
| Anti-CD127-PE | BD Pharmingen | 557938 | |
| Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh | BD Falcon | 352235 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-001-Cl | |
| Human Serum | Gemini Bio-Products | 100-512 | |
| Human T-activator CD3/CD28 | Life Technologies | 111.31D | |
| IL-2 | NIH Aids Research & Reference Reagent Program | 136 | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L34955 | |
| Anti-CD4-qdot-655 | Life Technologies | Q10007 | |
| Anti-CD25-PECy5 | eBiosciences | 15-0259-42 | |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBiosciences | 00-5523-00 | |
| Anti-FOXP3-PE | eBiosciences | 12-4776-42 | |
| Anti-HELIOS-FITC | Biolegend | 137204 | |
| Anti-CTLA4-APC | BD Pharmingen | 555855 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C34557 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Life Technologies | V12883 | |
| HEPES | Mediatech | 25-060-Cl | |
| Treg Suppression inspector | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Anti-CD4-APC | BD Pharmingen | 340443 | |
| Anti-CD8-AF700 | BD Pharmingen | 557945 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Glutamine | Mediatech | 25-002-Cl | |
| Materials | |||
| BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364606 | |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | – | |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | – | |
| FlowJo | Tree Star | v887 |
References
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Buchbinder, S. P., et al. Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the Step Study): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concept trial. Lancet. 372 (08), 1881-1893 (2008).
- Pitisuttithum, P., et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled efficacy trial of a bivalent recombinant glycoprotein 120 HIV-1 vaccine among injection drug users in Bangkok, Thailand. J. Infect. Dis. 194, 1661-1671 (2006).
- Morse, M. A., et al. Depletion of human regulatory T cells specifically enhances antigen-specific immune responses to cancer vaccines. Blood. 112, 610-618 (2008).
- Furuichi, Y., et al. Depletion of CD25+CD4+T cells (Tregs) enhances the HBV-specific CD8+ T cell response primed by DNA immunization. World J. Gastroenterol. 11, 3772-3777 (2005).
- Rech, A. J., Vonderheide, R. H. Clinical use of anti-CD25 antibody daclizumab to enhance immune responses to tumor antigen vaccination by targeting regulatory T cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1174, 99-106 (2009).
- Ruter, J., et al. Altering regulatory T cell function in cancer immunotherapy: a novel means to boost the efficacy of cancer vaccines. Front Biosci. 14, 1761-1770 (2009).
- Moreno-Fernandez, M. E., Rueda, C. M., Rusie, L. K., Chougnet, C. A. Regulatory T cells control HIV replication in activated T cells through a cAMP-dependent mechanism. Blood. 117, 5372-5380 (2011).
- Schulze Zur Wiesch, J., et al. Comprehensive analysis of frequency and phenotype of T regulatory cells in HIV infection: CD39 expression of FoxP3+ T regulatory cells correlates with progressive disease. J. Virol. 85, 1287-1297 (2011).
- Kinter, A., et al. Suppression of HIV-specific T cell activity by lymph node CD25+ regulatory T cells from HIV-infected individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3390-3395 (2007).
- Moreno-Fernandez, M. E., Presicce, P., Chougnet, C. A. Homeostasis and function of regulatory T cells in HIV/SIV infection. J. Virol. , (2012).
- Angin, M., et al. Preserved Function of Regulatory T Cells in Chronic HIV-1 Infection Despite Decreased Numbers in Blood and Tissue. J. Infect. Dis. 205, 1495-1500 (2012).
- Seddiki, N., et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med. 203, 1693-1700 (2006).
- De Jager, P. L., et al. The role of the CD58 locus in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 5264-5269 (2009).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
- Salomon, B., et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity. 12, 431-440 (2000).
- Malek, T. R., Bayer, A. L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nat. Rev. Immunol. 4, 665-674 (2004).
- Hoffmann, P., Eder, R., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Edinger, M. Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4(+)CD25high regulatory T cells. Blood. 104, 895-903 (2004).
- Putnam, A. L., et al. Expansion of human regulatory T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes. 58, 652-662 (2009).
- Kreijveld, E., Koenen, H. J., Hilbrands, L. B., Joosten, I. Ex vivo expansion of human CD4+ CD25high regulatory T cells from transplant recipients permits functional analysis of small blood samples. J. Immunol. Methods. 314, 103-113 (2006).
- Ebinuma, H., et al. Identification and in vitro expansion of functional antigen-specific CD25+ FoxP3+ regulatory T cells in hepatitis C virus infection. J Virol. 82, 5043-5053 (2008).
- Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS ONE. 4, e5994 (2009).
- Heredia, A., et al. Rapamycin causes down-regulation of CCR5 and accumulation of anti-HIV beta-chemokines: an approach to suppress R5 strains of HIV-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10411-10416 (1073).
- Hoffmann, P., et al. Only the CD45RA+ subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T-cell lines upon in vitro expansion. Blood. 108, 4260-4267 (2006).
- Hoffmann, P., et al. Loss of FOXP3 expression in natural human CD4+CD25+ regulatory T cells upon repetitive in vitro stimulation. Eur. J. Immunol. 39, 1088-1097 (2009).
- Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J. Exp. Med. 192, 303-310 (2000).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. J. Immunol. 184, 3433-3441 (2010).
- Zheng, S. G., Gray, J. D., Ohtsuka, K., Yamagiwa, S., Horwitz, D. A. Generation ex vivo of TGF-beta-producing regulatory T cells from CD4+CD25- precursors. J. Immunol. 169, 4183-4189 (2002).
- Gregori, S., Roncarolo, M. G., Bacchetta, R. Methods for in vitro generation of human type 1 regulatory T cells. Methods Mol. Biol. 677, 31-46 (2011).
