Lichte voorkeur Assay om Aangeboren en Circadiaanse Gereglementeerde Photobehavior studeren in<em> Drosophila</em> Larven
Summary
Hier beschrijven we een licht-donker voorkeur test voor Drosophila larven. Deze test geeft informatie over aangeboren en circadiane regulatie van licht sensing en verwerken photobehavior.
Abstract
Licht fungeert als milieu-signaal naar het gedrag van dieren op verschillende niveaus te controleren. De Drosophila larvale zenuwstelsel wordt gebruikt als een uniek model om fundamentele vragen over hoe licht informatie wordt verwerkt en gedeeld tussen snelle en circadiane gedrag te beantwoorden. Drosophila larven weer een stereotype vermijdingsgedrag bij blootstelling aan licht. Aan het licht afhankelijke gedrag vergelijkbaar eenvoudige licht-donker voorkeur tests kunnen worden toegepast onderzoeken. In gewervelde dieren en geleedpotigen de zenuwbanen betrokken bij het voelen en verwerken van visuele input gedeeltelijk overlappen met die verwerking fotische circadiane informatie. De interessante vraag hoe het lichtgevoelige systeem en circadiane systeem communiceren gedrag outputs gecoördineerd blijven grotendeels onontdekt. Drosophila is een botsend biologisch model om deze problemen te benaderen, door een klein aantal neuronen in de hersenen en de beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen voor neuronale MANIPULatie. De gepresenteerde licht-donker voorkeur test laat het onderzoek van een reeks visuele gedragingen waaronder circadiane controle phototaxis.
Introduction
Hier beschrijven we een gedrags test op basis van de larvale voorkeur voor donker (of licht). Larven reageren met een sterke en stereotiep photonegative respons tijdens foerageren fasen (L1 tot begin L3) 1. De test is bedoeld om de photophobic gedrag van de larve beoordelen en vergelijkt de lichte of donkere voorkeur een groep larven vrij bewegen in een petrischaal bedekt met agar. Dit gedrag assay geeft niet alleen informatie over de gevoeligheid, integratie en temporele plasticiteit van het visuele systeem, verschaft verder aanwijzingen hoe lichtgevoeligheid en wordt gecontroleerd door het circadiane systeem.
De Drosophila larvale oog (ook wel Bowlig Organ; BO), is het belangrijkste orgaan voor lichte waarneming. Elk oog is samengesteld uit 12 fotoreceptoren (PR), acht PR drukken de groengevoelige rhodopsin6 (rh6) en vier PR drukken de blauwgevoelige rhodopsin5 (RH5) 2,3. Naast PR, also klasse IV multidendritic neuronen, die het larvale lichaam muur bedekken, zijn geïdentificeerd om te reageren op schadelijke lichtintensiteiten 4,5. Het is ook bekend dat de pacemaker neuronen gelegen in de centrale larvale hersenen uiten het lichtgevoelige eiwit Cryptochrome (Cry) dat fungeert als klok intrinsieke blauw licht sensor in de hersenen 6,7. Intrigerend photophobicity van wild type dieren toont een circadiane component op verschillende tijdstippen in de loop van de dag en nacht bij het testen met deze test. Reacties op licht van foeragerende L3 larve bleek sterker photophobicity bij zonsopgang en lagere photophobicity in de schemering tijdens tests voor licht-donker voorkeur 7. Interessant alleen Rh5-PR's zijn nodig voor licht vermijden, terwijl Th6-PR's zijn overbodig. Beide, Rh5-PR's en Th6-PR's zijn betrokken bij het resetten van de moleculaire klok door licht 8. De Cry traject moet worden gecoördineerd met de andere licht-sensing paden naar een passende gedrags-output in de orkestrerenloop van de dag. Acetylcholine in PR speelt een essentiële rol in het licht vermijdingsgedrag alsmede meevoeren van de moleculaire klok. Het blokkeren van acetylcholine neurotransmissie van PR tot circadiane pacemaker neuronen reduceert de photophobic reactie in het licht-donker voorkeur test 8. Gebruikmakend van dezelfde test, hebben twee symmetrische paren van neuronen is onlangs geïdentificeerd aan het licht voorkeur van het derde larvale instar van Drosophila 9 schakelen. Deze twee paren van neuronen kunnen functioneren tijdens de late larvale stadia, wanneer dieren het voedsel om vermoedelijk te vinden een geschikte verpopping plaats. Echter, de vraag hoe de visuele pathways interactie en controle larvale visuele gedrag op een circadiane manier blijft grotendeels onbeantwoord. De lichte voorkeur assay maakt vergelijkingen tussen circadiane tijdstippen, vliegen lijnen en circadiane staat onder verschillende licht kwaliteiten. De test is eenvoudig voorbereid en goedkoop en is nuttig geweest eerder in verschillende labs te beschrijven en te bestuderen licht afgeleid gedrag in de larve.
Protocol
Representative Results
Discussion
De lichte voorkeur beschreven test maakt gebruik van de larvale aangeboren photobehavior. De test is eenvoudig vast te stellen, kunnen veel herhalingen tegen lage kosten en levert waardevolle informatie over licht sensing en verwerking. De experimentele paradigma maakt relatief snelle kwantificering van hoeveel mensen de voorkeur licht of donker. Een dergelijke voorkeur kan worden weergegeven als ruwe percentages of als alternatief als Preference Index (PREF). De PREF wordt uitgedrukt als het verschil van dieren die de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken onze collega's van het Departement Biologie, Universiteit van Fribourg voor vruchtbare discussies. Wij danken de Bloomington Stock Centrum voor het verstrekken vlieg voorraden. Dit werk werd financieel ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (PP00P3_123339) en de Velux Stichting SGS
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A5093-500G | 2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland |
| Petri dishes | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | 90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria |
| LEDs Lamp | OSARAM | 80012 White | LED lamp, 80012 White |
| Environment Meter | PCE | PCE EM882 | Lux, Temp, RH% |
| Thermostatic cabinet | Aqua Lytic (Liebherr) | ET636-6 | |
| Light timer | Timer T | 6185.104 | 230V/50HZ (check specifications for your country) |
| Universal thermostat | Conrad | UT200 | |
| Humidifier | Boneco | ||
| Balck tape | Tesa | 5 cm | |
| Glue | Uhu | ||
| lncubator lamp | Phillips | Softtone | 5W |
| Timer clock | Ziliss | Ziliss, Switzerland | |
| Excel Software | Microsoft | Excel | |
| Origin Software 8.5 | OriginLab | ||
| Backer Yeast | Migros Switzerland | ||
| Iron support stand 17X28CM | Fisher Scientific | S47808 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283-100ML | 20% acetic acid dilluted in H2O |
| Red light lamp | Phillips | PFE712E*8C | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Power supply | EA | EA PS 2042-06B | Optional |
| Aluminium foil | Prix Coop | ||
| Heater | GOON | NSB200C | |
| Microwave Oven | Intertronic | ||
| Standard corn meal fly food | |||
| Destilled water |
References
- Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development. J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).
- Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates. Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454, 533-537 (2008).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Diaz, N. N., Sprecher, S. G. Photoreceptors: unconventional ways of seeing. Curr. Biol. 21, R25-R27 (2011).
- Emery, P., et al. Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor. Neuron. 26, 493-504 (2000).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293-300 (2005).
- Keene, A. C., et al. Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment. J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).
- Gong, Z. F., et al. Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference. Science. 330, 499-502 (2010).
- Lilly, M., Carlson, J. smellblind: a gene required for Drosophila olfaction. Genetics. 124, 293-302 (1990).
- Bodenstein, D., Demerec, M. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).
- Pittendrigh, C. S. Circadian systems: Entrainment. Biological Rhythms. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, 95-124 (1981).
- Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila. Neuron. 74, 706-718 (2012).
- Keene, A. C., Sprecher, S. G. Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae. Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
