Elektrofizyoloji Tabanlı Katı Desteklenen Membran Giriş

1. SSM tabanlı Elektrofizyoloji için bir cihaz ayarlama Detayları da şematik çizimler ve küvetler fotoğraflarını içeren ve 1, 2 kurmak teknik yayınlar, iki verilmiştir. Farklı bir çözüm Döviz yapılandırmaları ve akış protokolleri aynı zamanda yöntemi kağıt 2 tartışılmıştır. Aşağıda bir kaç son gelişmeler ve video sunumu için doğrudan ilgili olan teknik ayrıntıları ekleyin. Valf kontrolü ve veri toplama Arayüz kutusu ticari bir USB dijital çıkış / analog giriş arabirimi (NI USB 6009 National Instruments) ve valf sürücüleri içerir. Bu çözelti akışını kontrol ve veri toplama için sorumludur. Vanalar normalde hızlı vanalar 18 kadar bir gerilim ile tahrik V. Videoda bir 12 V güç kaynağı kullanmak olabilir geçiş için, Ancak 12 ile tahrik V. vardır. </ P> Vana sürücü devre kartı dört valf çalışabilir. Bu Biyofizik Max Planck Enstitüsü servis tarafından imal edilmiştir. Vanalar ön panelde anahtarı üzerinden bilgisayar veya el ile kontrol edilebilir. İkinci temizlik işlemleri ve yıkama için uygundur. Ölçüm sırasında, arayüz kutusu bir vana kontrolü ve veri toplama yazılımı (surfe 2 R yazılımı, IonGate Biosciences) kullanarak bilgisayar kontrollü olduğunu. 2. Hazırlıklar Bu bölümde bir SSM-tabanlı deney elektrofizyoloji hazırlanması için farklı protokoller bahsedilmiştir. 2.1 SSM oluşumu için Lipid çözüm yapma 25 ul oktadesilamin (Kloroform içerisinde 5 mg / ml) ve bir cam şişe içinde 375 ul Diphytanoylphosphatidylcholine (Kloroform içinde 20 mg / ml) karıştırın. Bir döner buharlaştırıcı ve sürekli bir nitrojen gazı akışı kullanılarak, için kloroform buharlaşmasıyaklaşık 30 dakika. N-dekan 500 ul ile çalkalayarak cam şişe duvarlarından lipid çıkarın. Nihai lipit konsantrasyonuna 1:60 (w / w) oktadesilamindir ile 15 mg / ml 'dir. Cam saklama kabı çözüm aktarın. -20 ° C'de lipid çözüm Mağaza Referans elektrotunun 2.2 Klorlama Referans elektrotlar aşınma nedeniyle düzenli aralıklarla klorlu gerekir. Klorlama işleminden önce ince zımpara kullanarak eski gümüşklorid tabakasının dayanağını çıkarın. 1 M hidroklorik asit solüsyonu içine bir platin elektrot ile birlikte gümüş tel yerleştirin ve 0,5 mA, 15 dakika boyunca klorlama. Klorlama tamamladıktan sonra, gümüş tel homojen bir koyu gri rengini değiştirir. Poliakrilamid jel köprünün 2.3 hazırlanması 100 mM pH değerinde KPI = 7, 100 mM KCI, 6 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın% Acrylamid. % 0.3 APS (% 10 Stok) ekleyin ve% 0.6 TEMED ve kısa bir pipet ile çözüm karıştırın. Hemen çözelti karıştırıldıktan sonra, boş jel köprü kabına karışım, 30 ul enjekte etmek için bir pipet kullanın. Bu enjeksiyon sırasında hava kabarcıklarını önlemek için önemlidir. 20 dakikalık bir inkübasyon süresi sırasında jel polimerize olur. Polimerizasyon sonrası jel köprü çözeltisi (100 mM KPI pH 7, 100 mM KCI) depolanır. Jel köprünün ömrünü uzatmak için, çözelti 4 ° C sıcaklıkta saklanır Ölçüm çözümler 2.4 hazırlanması Farklı bileşimin çözümler değiştirilmesi durumunda, SSM çözünenlerin kuvvetli etkileşime bağlı olarak, elektrik eserler oluşturulur. Bu nedenle, solüsyonların hazırlanması için önemli bir adımdır. Çözüm Döviz eserler en aza indirmek için çözüm hazırlık sürecinde aşağıdaki önlemleri alın. Olmayan aktive ve bir partiden çözümler aktive olun, pH ve iyonik kuvvet ayarlayın. Yüksek tuz arka plan çözüm Döviz eserler azaltmaya yardımcı olur. Iki cilt halinde toplu çözüm bölün. Aktive çözeltisine aktive edici bileşik ekleyin. Mümkün olduğunca benzer ozmolarite ve her iki çözüm iyonik gücünü tutmak için olmayan aktifleştirici çözelti içinde bir telafi edici bileşiğin kullanımı. Çözümleri 4 ° C'de saklanır ise, sıcaklık hatta küçük farklılıklar eserler üretebilir çünkü tüm çözümler, bir ölçüm başlamadan önce oda sıcaklığına ulaşıldığında emin olun. 3. Bir SSM tabanlı Elektrofizyoloji Deney Burada bir SSM-tabanlı bir deney elektrofizyolojik için tipik bir protokol mevcut. 3.1 SSM Kurulum hazırlanması SSM Kurulum kullanımda değilken tüpleri% 30 etanol ile doldurulur/ Su çözeltisi bakteri büyümesini önlemek için. Küvet monte etmeden önce, borunun ikinci etanolü ortadan kaldırmak için saf su ile yıkama sistemi. Su kapları ile etanol kaplar değiştirin. Yüksek basınç (0.6 ila 1.0 bar) yaklaşık 20-30 ml su ile sistem temiz kullanma. PH 7.6 ya da olmayan aktive çözüm bir 100 mM KPI tampon kullanarak temizleme işlemi tekrarlayın. Hava kabarcıkları sıvı sistemde kalır emin olun. 3.2 küvet Montaj Referans elektrot bir o-ring takın Saklama çözeltisinden jel köprüyü ve referans elektrotu, bağlayın. Önceden doldurunuz olmayan aktive tamponu ile çıkış konektörü, bir o-ring takın ve referans elektrot montaj tamamlamak için jel köprü bağlayın. Hava kabarcığı jel köprü ve çıkış çözelti akış yolunun kavşağında olduğunu özel dikkat gösterin. Cuve ana parçası Preassembleyaylı kontak pin (amplifikatör bağlantısı), giriş borusu (terminal vana bağlantı), o-ring (SSM için sızdırmazlık) ve vidaları ekleyerek tte. Bir cımbız kullanarak, depolama çözümü (etanol içinde 10 mM octadecanethiol) ve sensör çipi çıkarın. Bir pipet kullanarak, yakl kalan çözüm yıkayın. Saf etanol, 5 ml. Azot gazı altında elektrot kurutun. Giriş küvetin ana parçanın menfezi, böylece küvet taban kısmının üzerine doğru bir sensör çipi yerleştirin sensörün dairesel aktif alanına yönlendirilir. Sensör çipin aktif alanın lipid çözeltinin 1 ul ekleyin. Altın tabakası tam lipid kapalı olduğundan emin olun. Hemen lipid çözeltisi ilave edildikten sonra, önceden monte edilmiş bir ana bölümü ekleyerek küvet kapatın. Faraday kafesi içine küvet monte etmeden önce, tüm yüzeyler tamamen kuru olduğundan emin olun. Idareterminal valf için yaylı kontak pin ve giriş tüp amplifikatör ect. Daha sonra Faraday kafesi içindeki vida ile küvet düzeltmek. Küvet en üstüne çıkış konektörü takın. Son olarak, çıkış konektörü ve referans elektrot için voltaj jeneratörüne çıkış borusuna bağlanabilir. Hemen montaj sonra küvet 0,6 barda tamponu ile yıkama sistemi. Bu kendiliğinden SSM oluşumuna yol açar. 3.3 Ölçüm membran parametreleri SSM kalitesini kontrol etmek için, kapasite ve iletkenlik fonksiyon jeneratörü kullanılarak ölçülür. Fonksiyon jeneratörü kullanarak, iletkenlik ölçmek için 100 mV DC gerilim uygulanır. Iletkenlik hesaplayın: Mevcut çürüme membran kondansatör şarj gösterir. Kapasitör sonra tam olarak ölçülen akım verimleri Ohm kanunu kullanarak membran iletkenlik tahsil edilir. Basitlik uğruna biz cu kullanınrrent 1 saniye voltaj sonra iletkenlik G = I / ABD hesaplamak için uygulanan Genlik ve kapasite ölçmek için 0,5 Hz frekans zirve için 50 mV tepe bir üçgen AC gerilim uygulanmalıdır. Kapasite hesaplayın: elde edilen kare dalga akım genliği kapasitör şarj akımları temsil eder. Kapasite C transfer yüküne eşittir Q = ΔU = 100 mV bölünmesiyle IΔt. (Ben üçgen gerilim fark mevcut olumlu eksi negatif eğim olduğu için ΔU iki kez 50 mV uygulanan gerilimdir.) Art arda membran için yaklaşık her 10 dakikada bir elektriksel parametreler izleyin. Sabit değerler ulaşana kadar 30 ila 40 dk. 1-0,6 yaklaşık bar aralığında yüksek basınçta KPI tamponu ile arasında yıkayın. SSM kalitesi tahmin: optimal koşulların 0,1-0,2 nS ve 2-3,5 nF aralığında bulunmaktadır. 1 nF altında 0.8 nS ve düşük kapasite üzerinde bir yüksek iletkenlik gösterirSSM doğru oluşmuş olmadığını. 4 nF üzerinde bir yüksek kapasite aktif bölge SSM tarafından tamamen kapalı olmadığını anlamına gelebilir. Parametreleri uygun aralık içinde değilse, membran atılmalıdır ve başka SSM taze hazırlanmış bir elektrot çipi kullanılarak hazırlanmıştır. Çözüm Döviz eserler için 3.4 Denetimi Membran parametreleri kontrol edildikten sonra, ölçüm tamponlar çözüm alışverişi eserler için test edilmelidir. Sıvı sistemi için ilgili çözelti kapları yerleştirin. Manuel vanalar kullanarak, akışkan sistem hava kabarcıklarını çıkarın. Veri toplama yazılımı kullanmak, deneyde kullanmak istediğiniz akış protokolü seçti. 0,6 bar basınç ayarlayın ve ölçüm başlar. Ayrı mekanik kapak anahtarlama eserler, ideal bir eser akım ölçülmelidir ya da çok SMA olmalıdırbeklenen protein taşıma sinyalleri daha ller. Çözüm Döviz eserler gözlenmesi halinde, deney devam etmeden önce tampon kompozisyon ve / veya hazırlık işlemi optimize etmek için deneyin. 3.5 protein örnek ekleme Ortalama proteoliposomes ya da zar parçalarının -80 ° C'de saklanır Bir ölçüm için yaklaşık 30 ul'lik bir kısım gereklidir. Olmayan bir aktive edici çözeltisi ile SSM durulayın. Buz üzerinde protein örnek çözülme. Üç 10-saniye sonikasyon döngüleri buz üzerinde 10 sn soğutma aralıklarla dönüştürülebilir. Proteoliposomes banyo sonikatör kullanarak sonicated vardır. Membran parçaları için bir ipucu sonikatör (50W, 30 kHz, 1 mm sonotrode çapı, yoğunluğu% 20, çevrim 0.5) kullanılır. Son Sonication adımdan sonra buz geri örnek koymayın, ancak küvet içinde hemen enjekte. Sökün çıkış referans elektrot asse ile birlikte konektörümontajları. Bir pipet kullanarak, protein örnek 30 ul aspire ve delik prizine pipet monte edin. Atık kaba olmayan aktive yolunda manuel vanasını açın ve küvet hacmi içine proteoliposomes enjekte. Sensör ile küvet hacmi içine hava enjekte dikkat edin. Pipet çıkarmadan önce, daha fazla çözüm akışını önlemek için el vanasını kapatın. Proteoliposomes 1 ile 2 saat bir inkübasyon süresi için SSM yapışır izin verin. Bu, gece boyunca inkübe etmek de mümkündür. Bir SSM-tabanlı deney 3,6 Genel Prosedür 4 ° C'de saklandığında, zaman içinde ölçüm tamponlar Isınma Tüm ölçüm tamponlar eserler önlemek için ölçüm başlamadan önce oda sıcaklığında olması gerekir. Çözümler değiştirirken, ilk olmayan bir tüylenme doku ile çözüm kaplar içindeki tüpler temizleyin, sonra yeni şişe yerleştirin. Ölçüm başlamadan önce, değişen işlem evrimleşmiş olabilir hava kabarcıkları, kaldırmak için el vanaları kullanın. Sadece bir ölçüm başlamadan önce basıncını ayarlayın. Biz rutin özel valf ve boru yapılandırması, yaklaşık 1.0 ml / sn 'lik bir akış hızı sağlar 0.6 barlık bir basınç kullanımı. İlk birkaç ölçümler birbiri ardına düz bir yapılabilir ve tepe akımı sabit kalır kadar reddedilmelidir. Solüsyonları pH farklılık varsa, en az 3 dakika arasında bir inkübasyon süresi ölçümlerine başlamadan önce proteoliposomes iç pH değerini ayarlamak için gereklidir. Şimdi kurulum ölçüm için hazırdır. Gürültüyü azaltmak için en az 3 ölçüm yapılmış ve ortalaması alınmalıdır. 3.7 Kontrol Ölçümleri Ölçümler bir dizi sırasında bir sinyal özet protein yıkımı veya adsorpsiyon bir kaybı nedeniyle oluşabilir. Her SSM deney i olmalıdıryıkık bir denetim nclude. Bu aynı çözümleri ile tekrarlanan ölçümler yapılır. En az bir özet kontrolü aynı çözeltisi kullanılarak, tek bir ölçüm başında ve deney sonunda biri anlamına gelir. Biz deney en yüksek tepe genlik bekliyoruz koşullar altında yıkık kontrolü yapmak için tavsiye. Bu daha kolay sinyalin özet ölçmek için yapar. Sinyal özet iki özet kontrollerin zirve amplitüdleri arasında bir karşılaştırma ile tayin edilebilir. Elde edilen yüzde değeri hatlarıyla lineer bir zaman bağımlılığı varsayılarak ölçülen sinyallerin düzeltmek için kullanılabilir. 3.8 Artifact kontrolleri Mümkünse deney sonra ilgi inhibe protein, sonuçlarınızı doğrulamak için deneyin. Kalan sinyalleri muhtemelen çözüm Döviz eserler bulunmaktadır. Sinyallerin, daha sonra ölçülen eserler için düzeltilmesi gerekir. <p cDeney sonra lass = "jove_step"> 3.9 Saf 20-30 ml su ve% 30 etanol / 20-30 ml su ile yıkama sistemi. Sistem kullanımda değilken etanolik çözüm bakteri üremesi önler. Bu temizleme işleminden sonra, sistemden basıncı serbest bırakmak ve tüm aletleri kapatın. Faraday kafesi gelen küvet çıkarın ve bağlantısını kesmek. Küvet tüm parçaları bir banyo sonikatörü kullanılarak, gerekirse su ve saf etanol ile temizlenebilir. Saf etanol ile bir cam beher sensör çipi yerleştirin. Banyo sonikatör kullanılarak 2-1 dakika boyunca sonikasyon beher. Azot gazı altında sensör çipi kurutun. 10 mM'lik bir Octadecanthiol etanolik çözelti içinde ışıktan uzak sensör çipi saklayın. Yaklaşık 30 dakika arasında bir inkübasyon süresinden sonra sensör çipi yeniden kullanım için hazırdır.