電気生理学基づき固体支持された膜の概要

1。 SSMベースの電気生理学のための装置のセットアップ詳細はまた、当社のキュベットの概略図面や写真が含まれており、1、2を設定し、当社の技術的な出版物の2に示されている。別のソリューション交換構成とフロープロトコルも提案手法紙2で説明されています。 以下では、いくつかの最近の改善とビデオプレゼンテーションのための直接の関連がある技術的な詳細を追加します。 バルブ制御およびデータ収集インターフェースボックスは、市販のUSBデジタル出力/アナログ入力インタフェース（NI USB 6009ナショナルインスツルメンツ）とバルブドライバが含まれています。これは、溶液の流れを制御し、データ収集を担当する。バルブは、通常12で駆動される。しかし、高速スイッチング用バルブは18までの電圧で駆動することができますV.ビデオでは、我々は12 Vの電源を使用してください。 </ P> 弁駆動回路基板は、4つのバルブを操作することができる。それは、生物物理学のマックスプランク研究所の工房で製造されました。バルブはコンピュータによって制御するか、手動でフロントパネルのスイッチを経由してすることができます。後者は、クリーニング手順とをフラッシュするために便利です。測定中には、インターフェイス·ボックスは、バルブ制御およびデータ収集ソフトウェア（SURFE 2 Rソフトウェア、IonGate Biosciences）を使用して、コンピュータ制御される。 2。準備このセクションでSSMベースの電気生理学実験の調製のための異なるプロトコルが挙げられる。 2.1 SSMを形成するための脂質溶液を作る 25μlのオクタデシル（クロロホルム中5 mg / ml）でとGLASバイアル​​で375μlのDiphytanoylphosphatidylcholineを（クロロホルム中20 mg / ml）で混ぜる。 ロータリーエバポレーターおよび連続窒素気流を用い、クロロホルムを蒸発させるための約30分。 n-デカン500μlの振とうすることによりガラスバイアルの壁から脂質を取り除きます。最終脂質濃度は、1:60（w / w）のオクタデシルアミン、15 mg / mlのである。 ガラス貯蔵バイアルにソリューションを移す。 -20℃で脂質溶液を保存する参照電極の2.2塩素参照電極は、摩耗による定期的に塩素化されなければならない。 塩素化プロセスの前に目の細かいサンドペーパーを使用して、古いsilverchloride層の残りの部分を削除します。 0.5ミリアンペアで15分間1 M塩酸溶液と塩素系に白金電極と一緒に銀線を配置します。塩素化を完了した後、銀線は均質濃い灰色に変色します。 ポリアクリルアミドゲルブリッジの2.3調製でpH = 7、100 mMの塩化カリウムと6時の100mMのKPiを含む溶液を調製％がアクリルアミド。 0.3％APS（10％株式）とTEMED 0.6％を追加して、まもなくピペットでソリューションを混ぜる。 直ちに溶液を混合した後、空のゲルブリッジ容器に混合液30μlを注入するピペットを使用しています。注入時に気泡を避けることが重要である。 20分のインキュベーション時間の間にゲルが重合する。 重合後にゲルブリッジ溶液（100mMのpHが7のKPi、100mMの塩化カリウム）に格納されている。ゲル橋の寿命を延ばすために溶液を4℃で保存されます計測ソリューションの2.4準備異なる組成の溶液を交換するときにSSMと溶質の強い相互作用により、電気的アーティファクトが生成される。したがって、溶液の調製は重要なステップである。ソリューション交換アーチファクトを最小化するために溶液調製プロセス中に以下の点に注意してください。 1バッチからソリューションを非活性化し、活性化してください、pHとイオン強度を調整します。 高塩背景ソリューション交換アーチファクトを低減するのに役立ちます。 2ボリュームにバッチソリューションを分ける。 活性液に活性化化合物を追加します。可能な限り同様に両方のソリューションの浸透圧およびイオン強度を保つために、非活性化溶液中の代償化合物を使用してください。 溶液は4℃で保存されている場合、温度の小さな違いがアーティファクトを生成することができますので、すべてのソリューションは、測定を開始する前に室温に達していることを確認してください。 3。 SSMベースの電気生理学実験ここでは、SSMベースの電気生理学的実験のための標準的なプロトコルを提示します。 SSMのセットアップを準備する3.1 SSMセットアップが使用していない状態で、チューブを30％エタノールで満たされている/水、ソリューション、細菌の増殖を防ぐために。 キュベットを取り付ける前に、チューブからエタノールを除去し純水でシステムを洗浄します。水容器エタノール容器を交換してください。高圧（0.6から1.0バール）水20〜30 mlのシステムをクリーンを使用。 pHを7.6または非活性化ソリューションでの100mMのKPIバッファを用いた洗浄手順を繰り返します。 気泡が流体システムに残っていないことを確認してください。 3.2キュベット取り付け参照電極にO-リングを取り付け貯蔵溶液からゲルブリッジを取ると基準電極に接続します。 予備充填非活性化緩衝液出口コネクター、Oリングを挿入し、基準電極組立体を完成させるゲルブリッジを接続する。気泡がゲルブリッジと出口溶液流路の交差点にしていないことを特に注意してください。 醸造おけの主要部をPreassembleばねコンタクトピン（アンプへの接続）を添加することによりって、入口管（端末バルブへの接続）、Oリング（SSMためのシーリング）とネジ。 ピンセットを使用して、保存溶液（エタノール中の10mMオクタ）のセンサチップを取り出します。 ピペットを用いて、約で残った溶液を洗い流してください。純粋なエタノール5ml。 窒素ガス下電極を乾燥させる。 入口キュベットの主要部のボアように、キュベットの底部に正確にセンサチップを配置するセンサの円形のアクティブ領域に向けられている。 センサチップのアクティブ領域に脂質溶液を1μlを追加します。金の層が完全に脂質で覆われていることを、確認してください。 すぐに脂質溶液を加えた後、組み立て済みの主要部分を追加することで、キュベットを閉じます。 ファラデーケージにキュベットを取り付ける前に、すべての表面が完全に乾燥していることを確認してください。 コンばねコンタクトピンと端子弁への入口管に増幅器を電気ショック療法。その後、ファラデーケージの内側のネジでキュベットを修正。 キュベットの上部に出口コネクタをねじ込みます。最終的に出口コネクタと基準電極への電圧発生器に排出管を接続する。 すぐに実装後キュベットは0.6バールでバッファを使用してシステムを洗う。これは、自発的SSMの形成をもたらす。 3.3測定膜パラメータ SSMの品質をチェックするために、キャパシタンスとコンダクタンスは、関数発生器を用いて測定される。 関数発生器を使用して、コンダクタンスを測定するために100mVのDC電圧を印加する。 コンダクタンスを計算電流減衰は膜コンデンサの充電を示しています。コンデンサの後、完全に測定された現在の利回りをオームの法則を用いた膜コンダクタンスが課金されます。簡潔にするために、我々はCuを用いるrrent 1秒、電圧後コンダクタンスG = I / Uを計算するために適用されますピーク振幅と静電容量を測定する周波数0.5Hz〜50 mVのピークの三角波の交流電圧を印加する。 静電容量を計算し、得られた矩形波電流の振幅は、キャパシタの充電電流を表している。静電容量Cが転送された電荷に等しいQ =ΔU= 100 mVので割っIΔt。 （私は三角形の電圧の差が現在の正マイナス負の傾きであるため、ΔUは二度50 mVでの印加電圧である。） 約のために10分ごと繰り返して膜の電気的パラメータを監視します。定数値に到達するまで30〜40分間、。 1から0.6バールの範囲内の高圧でのKPI緩衝液との間に洗ってください。 SSMの品質を推定：最適なパラメータは、0.1から0.2、NSと2から3.5 nFのの範囲である。 1 nFの下0.8、NSと低容量以上の高コンダクタンスを示しSSMが正しく形成されない。 4 nFの上記の高静電容量は、アクティブなゾーンがSSMによって完全に覆われていないことを意味するかもしれない。 パラメータが最適な範囲にない場合、膜は廃棄されるべきであり、別のSSMは、新たに調製した電極チップを用いて、調製。 ソリューション交換アーティファクト3.4チェック膜パラメータがチェックされた後に、測定バッファは、溶液交換のアーティファクトについて試験されるべきである。 流体系にそれぞれのソリューションコンテナを挿入します。 手動バルブを使用して、流体システムから気泡を除去する。 データ収集ソフトを使用すると、あなたの実験で使用するフロープロトコルを選択しました。 0.6バールまでの圧力を調整し、測定を開始します。 メカニカルバルブスイッチングアーティファクトとは別に、理想的には全くアーチファクト電流を測定するべきではありませんか、または彼らははるかSMAであるべき予想されるタンパク質輸送信号よりミュラー。ソリューション交換アーチファクトが認められた場合には、実験を続行する前に、バッファ組成物お​​よび/または準備手順を最適化しようとする。 3.5タンパク質サンプルを追加する通常、プロテオリポソー​​ムまたは膜フラグメント-80℃で凍結保存されている℃、一回の測定のために約30μLのアリコートを必要とされている。 非活性化溶液とSSMをすすぐ。 氷の上でタンパク質試料を解凍。 3つの10秒の超音波処理サイクルは、氷の上で、10秒間隔で交互に冷却されています。プロテオリポソー​​ムを浴超音波処理を使用して超音波処理している。膜フラグメントのために先端超音波処理は（50W、30 kHzで、1ミリメートルのソノトロード径、強度20％、周期0.5）が使用されます。最後の超音波処理工程の後に氷の上に戻ってサンプルを入れていませんが、キュベットに、すぐにそれを注入する。 ネジを外し、出口は、参照電極ASSE一緒コネクターmbly。 ピペットを用いて、タンパク質試料の30μLを吸引し、穴コンセントにピペットチップをマウントします。 廃棄物容器への非活性化経路の手動弁を開き、キュベットボリュームにプロテオリポソー​​ムを注入。センサーでキュベット容積に空気を注入しないように注意してください。 ピペットチップを取り外す前に、さらに溶液流を防止するための手動弁を閉じます。 プロテオリポソー​​ムは、1〜2時間のインキュベーション時間のためにSSMに吸着することができます。それは一晩インキュベートすることも可能である。 SSMベースの実験の3.6一般的な手順 4℃で保存した場合、時間内に測定バッファを温めるすべての計測バッファはアーチファクトを回避するために測定を開始する前に室温でなければならない。 ソリューションを変更する場合は、最初の非ファジング組織とソリューションコンテナ内部管をきれいにし、新しいボトルを挿入します。 測定を開始する前に、変更手続きから進化した可能性が気泡を除去するために手動バルブを使用しています。 ただ、測定を開始する前に、圧力を調整します。私たちは、日常的に私たちの特定のバルブとチューブの構成で約1.0ミリリットル/秒の流量を得0.6バールの圧力を使用しています。 最初のいくつかの測定値は、別の後にまっすぐ1行うことができ、ピーク電流が一定になるまで拒否されるべきである。溶液はpHが異なる場合は、少なくとも3分のインキュベーション時間は、測定を開始する前に、プロテオリポソー​​ムの内側のpHを調節する必要がある。 今セットアップは測定のための準備ができている。ノイズを低減するには、少なくとも3の測定が行われ、平均化されるべきである。 3.7コントロール測定一連の測定時の信号ランダウンは、タンパク質分解または吸着による損失が大きくなって発生する可能性があります。各SSM実験は、私すべきランダウン制御をNCLUDE。これは、同一のソリューションを繰り返し測定することによって行われます。最小限のランダウンコントロールは、同じ溶液を使用して、1つの初めに測定し、実験の終了少なくとも一つを意味する。 私たちはあなたの実験で最も高いピーク振幅を期待する条件の下でランダウン制御を行うことをお勧めします。これは、簡単に信号の要約を定量化することができる。 信号ランダウンは、2つのランダウンコントロールのピーク振幅を比較することにより定​​量化することができる。得られたパーセンテージ値はランダウンの線形時間依存性を仮定することによって測定された信号を補正するために使用することができる。 3.8アーティファクトコントロール可能であれば、実験した後、目的の阻害タンパク質によってあなたの結果を検証してみてください。残りの信号はおそらくソリューション交換アーティファクトです。信号は次いで、測定されたアーティファクトを補正する必要がある。 <p c実験後、少女= "jove_step"> 3.9 純水20〜30 ml及び30％エタノール/水20〜30 mlでシステムを洗浄します。システムが使用されていないときエタノール溶液は、細菌の成長を回避する。 この清掃した後は、システムからの圧力を解放し、すべての楽器をオフにします。 ファラデーケージからキュベットを取り出して、それをマウント。キュベットの全ての部品は、浴超音波処理器を用いて、必要に応じて、水および純粋なエタノールで洗浄することができる。 純粋なエタノールでGLASビーカーにセンサーチップを置きます。風呂超音波処理を使用して約1〜2分間ビーカーを超音波処理。 窒素ガス下にセンサーチップを乾燥させる。 10mMのOctadecanthiolエタノール溶液中の光から離れたセンサチップを保管してください。約30分間のインキュベーション時間後に、センサチップは、再利用のために準備ができている。