Introduction à la membrane solide étayée par électrophysiologie

1. Mise en place d'un dispositif pour SSM à base d'électrophysiologie Des détails sont donnés dans deux de nos publications techniques, qui contiennent également des schémas et des photographies de nos cuves et mis en place 1, 2. Différentes configurations de change de solution et les protocoles de flux sont également abordés dans notre document de la méthode 2. Dans ce qui suit, nous ajoutons quelques améliorations récentes et les détails techniques qui ont un rapport direct à la vidéo de présentation. Vanne de régulation et d'acquisition de données Le boîtier d'interface contient un / interface commerciale USB numérique sortie analogique (NI USB 6009 de National Instruments) et les pilotes de la vanne. Il contrôle le débit de la solution et est responsable de l'acquisition des données. Les vannes sont normalement entraînés avec 12 V. Cependant, pour la commutation rapide des vannes peuvent être commandées avec une tension allant jusqu'à 18 V. Dans la vidéo, nous utilisons une alimentation de 12 V. </ P> Le circuit de commande de la valve peut fonctionner quatre soupapes. Il a été fabriqué par l'atelier de l'Institut Max Planck de biophysique. Les soupapes peuvent être commandées par ordinateur ou manuellement via les interrupteurs sur le panneau avant. Ce dernier est commode nettoyage-procédures-et rinçage. Pendant la mesure, le boîtier d'interface est contrôlée par ordinateur en utilisant une commande de la vanne et le logiciel d'acquisition de données (2 R surfe logiciel, IonGate Biosciences). 2. Préparatifs Dans cette section, les différents protocoles pour la préparation d'une expérience électrophysiologie SSM à base sont mentionnés. Faire 2.1 la solution de lipide pour la formation du SSM Mélanger 25 pl Octadecylamine (5 mg / ml dans le chloroforme) et 375 Diphytanoylphosphatidylcholine ul (20 mg / ml dans le chloroforme) dans un flacon de verre. L'utilisation d'un évaporateur rotatif et le flux continu de gaz d'azote, on évapore le chloroforme pourenviron 30 min. Retirez le lipidique sur les parois de la fiole de verre en le secouant avec 500 pi de n-décane. La concentration finale en lipides est de 15 mg / ml avec de 1:60 (p / p) octadécylamine. Transférer la solution dans le flacon de stockage en verre. Conserver la solution de lipide à -20 ° C. 2.2 La chloration de l'électrode de référence Les électrodes de référence doivent être chloré dans des intervalles réguliers due à l'abrasion. Retirer le reste de l'ancienne couche de silverchloride utilisant du papier abrasif fin avant le processus de chloration. Placer le fil d'argent avec une électrode de platine dans une solution d'acide chlorhydrique 1 M et chlorer pendant 15 min à 0,5 mA. Après avoir effectué la chloration, le fil d'argent change de couleur pour une couleur gris foncé homogène. 2.3 Préparation du pont sur gel de polyacrylamide Préparer une solution contenant 100 mM KPi à pH = 7, 100 mM de KCl et 6% D'acrylamide. Ajouter 0,3% APS (10% actions) et 0,6% TEMED et mélanger rapidement la solution avec une pipette. Immédiatement après le mélange de la solution, utiliser une pipette pour injecter 30 ul du mélange dans le récipient de pont de gel vide. Il est important d'éviter les bulles d'air lors de l'injection. Pendant un temps d'incubation de 20 min, le gel polymérise. Après polymérisation, le pont de gel est stocké dans une solution (KPI 100 mM pH 7, 100 mM KCl). Pour prolonger la durée de vie du pont de gel, la solution est conservée à 4 ° C. 2.4 Préparation des solutions de mesure En raison de la forte interaction des solutés avec le SSM, des artefacts électriques sont produites lorsque des solutions de composition différente sont échangés. Par conséquent, la préparation des solutions est une étape cruciale. Prenez les précautions suivantes pendant le processus de préparation de la solution pour réduire les artefacts de change de la solution. Faire de non-activation et activer des solutions d'un lot, d'ajuster le pH et la force ionique. Fond riche en sel contribue à réduire les artefacts de change de la solution. Diviser la solution de lot en deux volumes. Ajouter le composé d'activation de la solution d'activation. Utilisation d'un composé de compensation dans la solution non-activation pour maintenir l'osmolarité et la force ionique des deux solutions aussi semblables que possible. Si les solutions sont conservées à 4 ° C, assurez-vous que toutes les solutions ont atteint la température ambiante avant de commencer une mesure, parce que même de petites différences de température peuvent produire des artefacts. 3. Une expérience électrophysiologie SSM basée Nous présentons ici un protocole typique pour une expérience électrophysiologique SSM basée. 3.1 Préparation de l'installation de SSM Bien que la configuration de la SSM n'est pas utilisé, les tubes sont remplis avec un 30% d'éthanolSolution / eau afin d'éviter la prolifération bactérienne. Laver le système avec de l'eau pure pour éliminer l'éthanol à partir de la tuyauterie avant le montage de la cuvette. Remplacer les conteneurs d'éthanol avec des conteneurs d'eau. Utilisation de haute pression (0,6 à 1,0 bar) nettoyer le système avec 20-30 ml d'eau. Répétez la procédure de nettoyage en utilisant un tampon de 100 mM KPi à pH 7,6 ou solution non-activation. Assurez-vous qu'aucune bulle d'air dans le système de fluide. 3.2 Montage de la cuvette Fixer un joint torique à l'électrode de référence Prenez le pont de gel de la solution de stockage et connectez l'électrode de référence. Le raccord de sortie avec un tampon non-activation de pré-remplissage, à insérer un joint torique et relier le pont gel pour achever l'assemblage de l'électrode de référence. Faites attention à ce qu'aucune bulle d'air sont à la jonction du pont de gel et de la voie d'écoulement de la solution de sortie. Prémonter la partie principale de la cuve,TTE par adjonction de la broche de contact à ressort (connexion à l'amplificateur), le tube d'entrée (connexion à la valve de terminal), le joint torique (l'étanchéité de la SSM) et les vis. Utilisation d'une pince à épiler, prendre la puce de capteur de la solution de stockage (10 octadécanethiol mM dans l'éthanol). Avec une pipette, laver la solution restante avec env. 5 ml d'éthanol pur. Sécher l'électrode sous azote gazeux. Placer la puce de capteur avec précision sur la partie de base de la cuvette de telle sorte que l'orifice d'entrée de l'alésage de la partie principale de la cuve est dirigé vers la zone active circulaire du capteur. Ajouter 1 ul de la solution lipidique à la surface active de la puce de capteur. Assurez-vous que la couche d'or est entièrement couverte par le lipide. Immédiatement après l'ajout de la solution de lipide, fermer la cuve par l'addition de la partie principale préassemblé. Avant de monter la cuvette dans la cage de Faraday, assurez-vous que toutes les surfaces soient complètement sèches. Connect l'amplificateur à la broche de contact à ressort et le tube d'entrée de la soupape de raccordement. Fixez ensuite la cuvette avec les vis à l'intérieur de la cage de Faraday. Visser le raccord de sortie vers le haut de la cuvette. Enfin relier le tube de sortie pour le raccord de sortie et le générateur de tension à l'électrode de référence. Immédiatement après le montage laver la cuve du système avec un tampon à 0,6 bar. Cela conduit à la formation de SSM spontanée. 3.3 Paramètres de la membrane de mesure Pour vérifier la qualité de la SSM, la capacité et de la conductance sont évalués en utilisant le générateur de fonction. Utilisation du générateur de fonction, appliquer 100 mV tension continue de mesurer la conductance. Calculer la conductance: La décroissance du courant montre la charge de la capacité de la membrane. Après le condensateur est complètement chargée, les rendements actuels de mesure de la conductance de la membrane en utilisant la loi d'Ohm. Par souci de simplicité, nous utilisons le current 1 seconde après que la tension est appliquée pour calculer la conductance G = I / U. Appliquer une tension alternative triangulaire de 50 mV crête à crête d'amplitude et d'une fréquence de 0,5 Hz à mesurer la capacité. Calcul de la capacité: L'amplitude du courant d'onde carrée qui en résulte représente les courants de charge du condensateur. La capacité C est égale à la charge transférée Q = IΔt divisé par ΔU = 100 mV. (ΔU est le double de la tension appliquée de 50 mV parce que j'ai est la différence pente positive moins courant négatif de la tension triangulaire.) Surveiller les paramètres électriques de la membrane de façon répétée toutes les 10 minutes pendant env. De 30 à 40 min, jusqu'à ce que des valeurs constantes sont atteintes. Laver avec du tampon entre en KPi à haute pression dans la plage d'environ 0,6 à 1 bar. Estimer la qualité de la SSM: Les paramètres optimaux sont dans la gamme de 0,1 à 0,2 Ns et de 2 à 3,5 nF. Une conductance élevée au-dessus de 0,8 ns et une faible capacité inférieure à 1 nF indiqueque le MSS n'est pas correctement formé. Une capacité élevée au-dessus de 4 nF peut signifier que la zone active n'est pas complètement couvert par le SSM. Si les paramètres ne sont pas dans la plage optimale, la membrane doit être jeté et un autre SSM préparé, en utilisant une puce d'électrode fraîchement préparée. 3.4 Vérification des artefacts de change de la solution Après les paramètres de la membrane ont été vérifiés, les tampons de mesure doivent être testés pour des objets d'échange de solution. Insérer les récipients de solution respectives pour le système de fluide. Retirer les bulles d'air du système de fluide, en utilisant les vannes manuelles. Utilisation du logiciel d'acquisition de données a choisi le protocole de flux que vous souhaitez utiliser dans votre expérience. Régler la pression à 0,6 bar et lancer la mesure. Mis à part les artefacts de commutation de valve mécanique, idéalement, pas de courants d'artefacts doivent être mesurés ou ils devraient être beaucoup smaller que les signaux de transport de protéines attendus. Si les artefacts de change de solution sont observés, essayer d'optimiser les compositions de tampon et / ou la procédure de préparation avant de poursuivre l'expérience. 3,5 ajouter l'échantillon de protéine Habituellement protéoliposomes ou des fragments de membranes sont conservés congelés à -80 ° C. Pour une mesure d'une aliquote d'environ 30 pi est nécessaire. Rincer le SSM avec une solution non-activation. Décongeler l'échantillon de protéine sur la glace. Trois 10 sec cycles de sonication sont alternées avec 10 sec intervalles de refroidissement sur glace. Protéoliposomes sont traitées par ultrasons à l'aide d'un bain sonique. Pour des fragments de membrane d'un appareil à ultrasons de la pointe (50 W, 30 kHz, 1 mm de diamètre de la sonotrode, l'intensité de 20%, le cycle 0,5) est utilisé. Après la dernière étape de sonication ne pas mettre l'échantillon de retour sur la glace, mais l'injecter immédiatement dans la cuvette. Dévissez le connecteur de sortie avec l'électrode de référence assembly. Avec une pipette, aspirer 30 pl de l'échantillon de protéines et de monter la pointe de la pipette à l'alésage de sortie. Ouvrir la vanne manuelle de la voie non-activation pour le conteneur de déchets et de les injecter dans le volume protéoliposomes cuvette. Veillez à ne pas injecter de l'air dans le volume cuvette avec le capteur. Avant de retirer la pointe de la pipette, fermer la vanne manuelle pour éviter d'autres flux de solution. Laisser les protéoliposomes d'adsorption sur le SSM pour une durée d'incubation de 1 à 2 heures. Il est également possible d'incuber pendant la nuit. 3.6 Procédure générale d'une expérience basée sur SSM Réchauffez les tampons de mesure dans le temps, s'il est conservé à 4 ° C. Tous les tampons de mesure doivent être à température ambiante avant de commencer la mesure pour éviter les artefacts. Lors du changement de solutions, d'abord nettoyer les tubes à l'intérieur des récipients de solution avec un tissu non-fuzzing, puis insérer les nouvelles bouteilles. Avant de démarrer la mesure, utilisez les vannes manuelles pour enlever les bulles d'air, qui pourrait avoir évolué à partir de la procédure de changement. Régler la pression juste avant le démarrage d'une mesure. On utilise couramment une pression de 0,6 bar, qui dans notre vanne et le tube spécifique configuration donne un débit d'environ 1,0 ml / sec. Les premières mesures peuvent être effectuées directement l'un après l'autre et doivent être rejetées jusqu'à ce que le courant de crête reste constante. Si les solutions proposées diffèrent dans pH un temps d'incubation d'au moins 3 min est nécessaire pour ajuster le pH interne des protéoliposomes avant de commencer la mesure. Maintenant, la mise en place est prêt pour la mesure. Pour réduire le bruit au moins 3 mesures doivent être prises et une moyenne. 3.7 Mesures de contrôle Un récapitulatif du signal lors d'une série de mesures pourrait se produire en raison de la dégradation des protéines ou une perte d'adsorption. Chaque expérience de SSM dois-jenclure un contrôle de diminution des effectifs. Cela se fait par des mesures répétées avec des solutions identiques. Les moyens de commande de vissage minimale une mesure au début et l'autre à la fin de l'expérience, en utilisant la même solution. Nous vous recommandons de faire le contrôle de diminution des effectifs dans des conditions où que vous attendez le plus haut pic d'amplitude dans l'expérience. Cela rend plus facile à quantifier la diminution des effectifs du signal. La diminution des effectifs du signal peut être quantifiée par une comparaison des amplitudes des pics des deux contrôles délabrés. Le pourcentage ainsi obtenu peut être utilisé pour corriger les signaux mesurés par l'hypothèse d'une dépendance du temps linéaire de la diminution des effectifs. 3.8 Contrôles d'artefacts Si possible, essayez de valider vos résultats par inhibition de la protéine d'intérêt après l'expérience. Signaux restants sont probablement des artefacts de change de la solution. Les signaux doivent alors être corrigées pour les objets mesurés. <p class = "jove_step"> 3.9 Après l'expérience Laver le système avec de 20 à 30 ml d'eau pure et de 20 à 30 ml d'éthanol 30% / eau. La solution éthanolique d'éviter la croissance bactérienne lorsque le système n'est pas en cours d'utilisation. Après cette opération de nettoyage, relâchez la pression du système et de désactiver tous les instruments. Retirer la cuvette de la cage de Faraday et démonter. Toutes les parties de la cuve peuvent être nettoyés avec de l'eau et de l'éthanol pur, si nécessaire, en utilisant un bain de sonication. Placer la puce de capteur dans un bécher de verre avec de l'éthanol pur. Soniquer le bécher pendant environ 1 à 2 min à l'aide d'un bain de sonication. Sécher la puce de capteur sous azote gazeux. Conserver la puce de capteur à une distance de la lumière dans une solution éthanolique Octadecanthiol 10 mM. Après un temps d'incubation d'environ 30 minutes, la puce de détecteur est prêt à être réutilisé.