Inleiding tot de vaste Ondersteunde Membrane Gebaseerd Electrofysiologie

1. Het opzetten van een Inrichting voor SSM-based Electrofysiologie Details zijn te vinden in twee van onze technische publicaties, die bevatten ook schematische tekeningen en foto's van onze cuvetten en het opzetten van 1, 2. Andere oplossing uitwisseling configuraties en doorstroming protocollen worden ook besproken in onze methode van papier 2. In de volgende voegen we enkele recente verbeteringen en technische details die van rechtstreeks belang zijn voor de videopresentatie. Klepbediening en data-acquisitie De interface box bevat een commerciële USB digitale uitgang / analoge input interface (NI USB-6009 National Instruments) en de klep chauffeurs. Het controleert de oplossing vloeien en is verantwoordelijk voor data-acquisitie. Kleppen worden normaal aangestuurd met 12 V. Echter, voor het snel schakelen van de kleppen kan worden aangestuurd met een spanning tot 18 V. In de video gebruiken we een 12 V voeding. </ P> De klep driver printplaat kan werken vier kleppen. Het werd vervaardigd door het atelier van het Max Planck Instituut voor Biofysica. Kleppen kunnen worden gecontroleerd door computer of handmatig via schakelaars op het voorpaneel. Dat laatste is handig voor het spoelen-en schoonmaak-procedures. Tijdens de meting, de interface is computergestuurd met behulp van een afsluiter controle en data-acquisitie software (Surfe 2R software, IonGate Biosciences). 2. Voorbereidingen In dit hoofdstuk worden de verschillende protocollen voor de voorbereiding van een SSM-based elektrofysiologie experiment worden genoemd. 2.1 Het maken van de lipide oplossing voor de vorming van de SSM Meng 25 pl octadecylamine (5 mg / ml in chloroform) en 375 gl Diphytanoylphosphatidylcholine (20 mg / ml in chloroform) in een glas flacon. Met een rotatieverdamper en continue stikstofgas, verdampen de chloroformongeveer 30 minuten. Verwijder het lipide van de wanden van de glazen flacon door schudden met 500 gl n-decaan. De uiteindelijke lipide concentratie 15 mg / ml met 1:60 (w / w) octadecylamine. Breng de oplossing voor de opslag van glas flacon. Bewaar de lipide-oplossing bij -20 ° C. 2.2 Chlorering van de referentie-elektrode De referentie-elektroden moet gechloreerde met regelmatige tussenpozen door slijtage. Verwijder de rest van de oude zilverchloride laag met behulp van fijn schuurpapier voor de chlorering proces. Plaats de zilverdraad met een platina elektrode in een 1 M zoutzuuroplossing en chloreren gedurende 15 min bij 0,5 mA. Na het voltooien van chlorering, de zilveren draad verandert de kleur naar een homogene donkergrijs. 2.3 Bereiding van de polyacrylamide gel brug Bereid een oplossing die 100 mM KPi bij pH = 7, 100 mM KCl en 6% Acrylamide. Voeg 0,3% APS (10% Voorraad) en 0,6% TEMED en binnenkort de oplossing te mengen met een pipet. Direct na het mengen van de oplossing, pipetteer 30 ul van het mengsel te injecteren in de lege gel brug container. Het is belangrijk om luchtbellen tijdens de injectie te vermijden. Tijdens een incubatietijd van 20 minuten polymeriseren van de gel. Na polymerisatie van de gel brug wordt opgeslagen in oplossing (100 mM KPi pH 7, 100 mM KCl). Om de levensduur van de gel brug verlengen oplossing wordt bewaard bij 4 ° C. 2.4 Voorbereiding van de meting van oplossingen Door de sterke wisselwerking van de opgeloste stoffen met SSM worden elektrische artefacten gegenereerd wanneer oplossingen van een andere samenstelling worden uitgewisseld. Daarom is de bereiding van de oplossingen is een kritische stap. Neem de volgende voorzorgsmaatregelen tijdens het bereidingsproces oplossing om de oplossing te wisselen artefacten te minimaliseren. Maak niet-activeren en het activeren van oplossingen van de ene partij, de pH en ionische sterkte. Hoge zout achtergrond helpt om oplossing uitwisseling artefacten te verminderen. Verdeel de batch oplossing in twee volumes. Voeg de activerende verbinding aan het activerende oplossing. Gebruik compenserende verbinding in de niet-activerende oplossing voor de osmolariteit en ionische sterkte van beide oplossingen zo gelijk mogelijk te houden. Indien de oplossingen worden bewaard bij 4 ° C, of ​​alle oplossingen op kamertemperatuur voordat de meting, omdat zelfs kleine temperatuurverschillen artefacten produceren. 3. Een SSM-based Electrofysiologie Experiment Hier presenteren we een typisch protocol voor een SSM-based elektrofysiologische experiment. 3.1 Voorbereiden van de SSM Setup Terwijl de SSM Setup is niet in gebruik de buizen worden gevuld met een ethanol 30%/ Wateroplossing om bacteriegroei te voorkomen. Spoel het systeem met zuiver water om de ethanol uit de buis te verwijderen voordat het monteren van de cuvette. Vervang de ethanol containers met water containers. Met behulp van hoge druk (0,6-1,0 bar) reinigen van het systeem met 20-30 ml water. Herhaal de reinigingsprocedure met een 100 mM KPi buffer bij pH 7,6 of niet-activerende oplossing. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de vloeistof systeem. 3.2 Montage van de cuvet Bevestig een o-ring aan de referentie-elektrode Neem de gel brug van de opslag-oplossing en sluit de referentie-elektrode. Prefill de uitlaatconnector met niet-activerende buffer plaatst een o-ring en sluit de gel brug naar de referentie-elektrode samenstel te voltooien. Pas goed op dat er geen luchtbellen zijn op de kruising van de gel brug en de uitlaat oplossing stromingsroute. Assembleert het grootste deel van de cuvette door toevoeging van de veer contactpen (verbinding met de versterker), de inlaatbuis (verbinding naar de terminal klep), de O-ring (afdichting voor de SSM) en schroeven. Met behulp van een pincet, neem de sensor chip uit de opslag-oplossing (10 mM octadecanethiol in ethanol). Met behulp van een pipet, wassen de resterende oplossing met ca. 5 ml zuiver ethanol. Droog de elektrode onder stikstofgas. Plaats de sensor chip nauwkeurig op het basisdeel van de cuvet bij de inlaat boring van het grootste deel van de cuvet wordt naar de cirkelvormige actieve gebied van de sensor. Voeg 1 ul van de lipide oplossing van het actieve gebied van de sensor chip. Zorg ervoor, dat de goudlaag volledig wordt gedekt door de lipide. Onmiddellijk na het toevoegen van de lipide-oplossing, sluit de cuvette door toevoeging van de voorgemonteerde hoofdgedeelte. Voor de montage van de cuvet in de kooi van Faraday, er zeker van zijn dat alle oppervlakken volledig droog zijn. Connect de versterker naar de lente contact pin en de inlaatbuis naar de terminal klep. Bevestig vervolgens de cuvet met de schroeven in de kooi van Faraday. Schroef de uitlaat connector naar de top van de cuvette. Tenslotte sluit de afvoerbuis naar de uitgang connector en het voltage generator om de referentie-elektrode. Onmiddellijk na het monteren van de cuvet wassen van het systeem met buffer bij 0,6 bar. Dit leidt tot spontane vorming SSM. 3.3 Het meten van membraan parameters Om de kwaliteit van de SSM te controleren, zijn capaciteit en geleidbaarheid gemeten met behulp van de functie generator. Met behulp van de functie generator, gelden 100 mV gelijkspanning om de geleiding te meten. Bereken de geleiding: De huidige verval toont het opladen van het membraan condensator. Nadat de condensator volledig is opgeladen de gemeten huidige opbrengsten het membraan geleiding met behulp van de wet van Ohm. Voor de eenvoud gebruiken we de current 1 seconde nadat de spanning op de geleiding G = I / U. berekenen Breng een driehoekige AC spanning van 50 mV piek amplitude en een frequentie van 0,5 Hz tot de capaciteit te meten piek. Bereken de capaciteit: De amplitude van de resulterende blokgolf stroom vertegenwoordigt de laadstromen van de condensator. De kapaciteit C is gelijk aan de overgedragen lading Q = IΔt gedeeld door Au = 100 mV. (Au is tweemaal de aangelegde spanning van 50 mV, omdat ik het verschil huidige positieve minus negatieve helling van de driehoekige spanning.) Bewaken van de elektrische parameters van het membraan herhaaldelijk elke 10 min. gedurende ca.. 30 tot 40 min, totdat constante waarden worden bereikt. Wassen tussendoor met KPi buffer bij hoge druk in het traject van ongeveer 0,6 tot 1 bar. Schat de kwaliteit van de SSM: Optimale parameters in het traject van 0,1 tot 0,2 nS en 2 tot 3,5 nF. Een hoge geleidbaarheid boven 0,8 nS en lage capaciteit van minder dan 1 nF geeftdat de SSM niet correct gevormd. Een hoge capaciteit boven 4 nF kan betekenen dat de actieve zone niet volledig onder de SSM. Als de parameters niet in het optimale bereik moet het membraan worden weggegooid en andere SSM onder gebruik van een versbereide elektrode chip. 3.4 Controle voor oplossing uitwisseling artefacten Nadat het membraan parameters zijn gecontroleerd, dient de meting buffers worden getest oplossing uitwisseling artefacten. Plaats de respectievelijke oplossing containers naar de vloeistof systeem. Verwijder luchtbellen uit de vloeistof-systeem, met behulp van de handmatige kleppen. Met behulp van de data-acquisitie software koos de stroom protocol dat u wilt gebruiken in uw experiment. Stel de druk tot 0,6 bar en start de meting. Afgezien van de mechanische klep switching artefacten, idealiter geen artefact stromen worden gemeten of ze moeten veel sma wordenller dan het verwachte eiwit transport signalen. Als oplossing uitwisseling artefacten worden waargenomen, proberen om de buffer composities en / of de voorbereidingsprocedure te optimaliseren voordat u verder het experiment. 3.5 Het toevoegen van het eiwit monster Meestal proteoliposomen of membraan fragmenten worden opgeslagen bij -80 ° C. Voor een meting van een hoeveelheid van ongeveer 30 pl nodig. Spoel de SSM met niet-activerende oplossing. Ontdooi het eiwit monster op ijs. Drie 10-sec sonicatie cycli worden afgewisseld met 10-sec koeling intervallen op ijs. Proteoliposomen worden behandeld met geluidsgolven met een badsonicator. Voor membraanfragmenten een tip sonicator (50W, 30 kHz, 1 mm sonotrode diameter, intensiteit 20%, 0,5 cyclus) wordt gebruikt. Na de laatste sonificeren stap niet terug het monster op het ijs, maar injecteren onmiddellijk in de cuvet. Schroef de uitlaat connector samen met de referentie-elektrode assembly. Met behulp van een pipet, zuig 30 pi van het eiwit monster en monteer de pipet tip om de uitlaatboring. Open de handbediende klep in de niet-activerende pad naar de afvalcontainer en injecteer het proteoliposomen in de cuvet volume. Wees voorzichtig niet te lucht te injecteren in het volume van de meetcel van de sensor. Voor het verwijderen van de pipet tip, sluit de handmatige klep om verdere oplossing stromen te voorkomen. Laat de proteoliposomen te adsorberen aan de SSM een incubatietijd van 1-2 uur. Het is ook mogelijk om incubeer overnacht. 3.6 Algemene procedure van een SSM-based experiment Warm het meten van buffers in de tijd, indien bewaard bij 4 ° C. Alle buffers moeten meten bij kamertemperatuur voordat de meting artefacten te vermijden. Bij het wijzigen van oplossingen, verwijder eerst de buizen in de oplossing containers met een niet-fuzzing weefsel, plaats vervolgens de nieuwe flessen. Vóór het begin van de meting, gebruikt u de handmatige kleppen om luchtbellen, die zouden zijn ontstaan ​​uit de veranderende procedure te verwijderen. Stel de druk net voor het starten van een meting. We routinematig gebruik van een druk van 0,6 bar, die bij onze specifieke afsluiter en buizenconfiguratie levert een debiet van ongeveer 1,0 ml / sec. De eerste meting kan worden uitgevoerd direct na elkaar en afwijzing tot de piekstroom constant blijft. Indien de oplossingen verschillen in pH een incubatietijd van ten minste 3 minuten nodig om het inwendige pH van de proteoliposomen passen voordat de meting wordt gestart. Nu is de set-up is klaar voor de meting. Om de ruis te verminderen minstens 3 metingen moeten worden gemaakt en gemiddeld. 3.7 Controle Metingen Een signaal rundown tijdens een reeks metingen kan optreden als gevolg van afbraak van eiwitten of een verlies van adsorptie. Elke SSM experiment moet include een vervallen controle. Dit gebeurt door herhaalde metingen met identieke oplossingen. De minimale verlaging besturingsmiddelen een meting aan het begin en aan het eind van het experiment met dezelfde oplossing. Wij raden aan om de vervallen controle doen onder omstandigheden waarbij je de hoogste piek amplitude in het experiment verwachten. Dit maakt het gemakkelijker om de verlaging van het signaal kwantificeren. Het signaal vervallen kan worden gekwantificeerd door vergelijking van de piek amplitudes van de twee vervallen controles. Het verkregen percentage kan worden gebruikt om de gemeten signalen te corrigeren door uitgaande van een lineaire tijdsafhankelijkheid van het vervallen. 3.8 Artifact controles Indien mogelijk proberen om uw resultaten te valideren door het remmen van het eiwit van belang na het experiment. Overblijvende signalen zijn waarschijnlijk oplossing uitwisseling artefacten. De signalen hebben dan de gemeten artefacten te corrigeren. <p class = "jove_step"> 3.9 Na het experiment Spoel het systeem met 20-30 ml zuiver water en 20-30 ml 30% ethanol / water. De ethanolische oplossing vermijdt bacteriegroei wanneer het systeem niet gebruikt. Na deze reiniging procedure, laat de druk uit het systeem en schakel alle instrumenten. Verwijder de cuvette uit de Faraday kooi en het demonteren. Alle onderdelen van de cuvette kan worden gereinigd met water en zuivere ethanol, indien nodig, met behulp van een badsonificeerinrichting. Plaats de sensor chip in een glas beker met zuivere ethanol. Sonificeer het bekerglas gedurende 1 tot 2 minuten met een badsonificeerinrichting. Droog de sensor chip onder stikstofgas. Bewaar de sensor chip uit de buurt van licht in een 10 mM Octadecanthiol oplossing in ethanol. Na een incubatietijd van ongeveer 30 minuten de sensor chip is klaar voor hergebruik.