Mikrovasküler Fonksiyon ve Tadilat üzerine Arteriolar Ligasyonu etkisini değerlendirmek için mürin Spinotrapezius Modeli

1. Spinotrapezius Yem Arter Ligasyonu Cerrahisi Intraperitoneal enjeksiyonu ile fare uyuştur. , 0.5 ml şırınga içinde, formüle: 100 mg / ml 0.06 ml ketamin 20.0 mg / ml, 0.03 ml Xylazine 0.4 mg / ml, 0.01 ml Atropin % 0.9 Saline 0.30 ml. Doz: 0.01 ml * gram vücut ağırlığı başına, ip Fare zorlanma ve stok üzerine * Doz değişken indüksiyon bir saat içinde bu kadar fare kurtarma olduğunu buna göre ayarlayın. Kornea kuruma önlemek için standart oftalmik merhem uygulayın. Tüy dökücü krem ​​kısa uygulaması takip kırpma makası kullanarak arka saç çıkarın. Klorheksidin veya povidon-iyot ile cerrahi alanında dezenfekte edin. Povidon-iyot ile biten etanol üç kez Alternatif povidon-iyot,. Isıtıcı ped ve steril örtü ile, önceden hazırlanmış cerrahi çalışma yüzeyi fare aktarınyerde. Tenting ile doku iris makas ve standart desen forseps (örneğin FST, 11271-30) kullanarak ve paralel kesme kürek kemikli öne kaudal yaklaşık 5 mm dorsal deri yoluyla doğrusal bir kesi (3-5 mm) oluşturma omurga. Hedef kesi yeri deri pigmentasyonu veriyorsa dorsal yağ yastığı transdermal görselleştirme tarafından tespit edilebilir; yağ pedinin kaudal sınırında kesti. Gerektiği gibi kesi genişletin ve yay makas kullanılarak sekonder deri katmanları aracılığıyla genişletmek. Anatomik notu – spinotrapezius kas dorsal yatıyor ve omurganın her iki tarafında L3 T4 uzanır. Ön sınırından yaklaşık omuz bıçak yanal olarak uzanır. Kası en posterior sınır anterior sınırına medial yatıyor ve omurga ile aynı hizada koyabilir böylece kaudal yönde tapers. İki yağ yastıkları spinotrapezius doğrudan dorsal ve ventral döşeme de dikkat etmek önemlidirkranial yarısına doğru kas. Insizyon nedeniyle iltihap sham ligasyon ameliyatı spinotrapezius vaskülatürün biçimlenme hiçbir değişiklik gösterdiği gibi, vasküler remodeling cevabı üzerinde herhangi bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. İki mekansal faktörlerin bu sonuca katkıda bulunmaktadır. İlk olarak kesik kas vasküler response tipik olarak incelenmiştir ilgi bölgesi gelen kafatası yönde 5 mm ile uzaklaştırılır. Buna ek olarak, dorsal deri üzerinde kesi spinotrapezius kas kafatası üçüncü tepesinde yer alan bir ventral yağ ped ile damar ligasyon yer ayrılır. Kas kuruma önlemek için ısıtılmış Ringer solüsyonu ile kesi sulayın. Böyle papaverin gibi vazodilatörlerin Uygulama ligasyonu için hedef arter görselleştirmek yardımcı olacaktır. Diseksiyon mikroskobu altında yatan musc (kaldırmasını değil ama) teşrih künt ve ayırmak için dorsal beyaz yağ yastığı forseps kullanıngirer ve onun yan kenarında spinotrapezius yapraklar gibi damarsal görselleştirmek amacıyla ular doku. Bir ya da iki ikili damarları ile birlikte, kas yanal kenarına kendi yolu üzerinde spinotrapezius ventral bir yağ yastığı içinden geçen hedef arter, Yerleştirme. Bu arter yansıtan ve kas içinde arter yol izlemek için kas değiştirilmesi ile teyit edilebilir kas, kuyruk yarım önemli bir kısmını besler. Ligasyon için hedef konumu arter ventral yağ yastığı çıkma ve kas girme segmentinde olduğunu ve bu bölgede oldukça erişilebilir. Arter damar çift yavaşça bu bölgedeki yağ ventral ped ayrılması gerekebilir. Spinotrapezius transvers dorsal ve ventral yağ yastıkları ya o gemiler de dahil olmak üzere, birden fazla arter-ven çiftleri beslenmektedir unutmayın. Bu gemilerin bozmaya dikkat edin. Çoklu göstergeler arter ayırt etmek için kullanılabilirvenden. En iyi yöntemlerden biri yavaşça mikroprob ile kan akışını engelleyebilir ve kas uzak yukarı taşımak için; tıkanıklık serbest bırakılıncaya kadar ak arter devam etmeyecektir. Ven duvarlarının arterler eksikliği bağ dokusu bir beyazımsı kılıf içerdiğinden Renkli da kullanılabilir. Damarlar genellikle büyük boyutta olduğu gibi Ayrıca, bir vazodilatör uygulamasından önce çapı düşünebilirsiniz. Arter ile eşleştirilmiş damar yakın olarak, tipik olarak, arter arkasında mikroprob geçen, ve doğal olarak daha geniş bir boşluk sağlamak için ucunu kullanarak, bir mikroprob ve yaklaşık olarak 5 mm kademeli bir izole etmek için 5. forseps ile diseksiyon kullanmak arter ve ven arasındaki yarık. Bu dikiş dişli olacak hangi aracılığıyla boşluğudur. 10-0 tek iplik dikiş ve iğne tutucu bir yer cerrahın düğüm kullanarak disseke segmentinin proksimal sonuna doğru yem arter (~ 70 mikron çapında) etrafında bir ligasyon kullanma. Plaarter kesisi izin vermek için ligatür arasında yeterli ayırma işlemi ile parçalanmış arter kademeli bir mafsaldan uzak ucuna doğru ce ek bir ligasyon. Spinotrapezius besleme arter ile ilişkili küçük ölçekte; femoral arter gibi daha büyük bir kap ligasyonu ile karşılaştırıldığında, artan cerrahi zorluk yol açar. Deneyimsiz cerrahlar özellikle avulsiyonu, yanlışlıkla kanama ve diğer cerrahi komplikasyon oranları yüksek olacaktır. Özellikle kaygı belirlenmesi ve akış sadece kesim öncesi engellemiştir sonra renksiz arter kesme güçlüktür. Cerrah arter hem de ligatür 2 arasında kolayca gözlemlenebilir ayırma ile kesilmiş bir onay transeksiyonu için burada yerini görsel bir kılavuz olduğu gibi bu nedenlerden dolayı, 2 ligatür yerleştirilmesi prosedür alışık için tavsiye edilir. Ancak, daha deneyimli bir cerrah sürece onlar açıkça mümkün olduğu gibi, tek bir bağ yeterli bulabilirbelirlemek ve bağ ve arter aşağı kesti. Bu tekniğin istemeden keskin ligasyonu sütür ile yakındaki bir gemi nicklemek riskini azaltır iken, bu arterlerde kesmiş olduğu teyit artan güçlüğü gibi sakıncaları olmadan değildir. Kan akımının azalmasına (tıkalı RBC sütun) ligasyon sitenin mansap (kas doğru yani) gözlemleyerek ligasyon doğrulayın. Kullanılması kesme makasları iki bitişik harfler arasında bağlanan arter transect. Sadece tek bir bağ yerleştirilmiş olur (11a) aşağı doğrultuda son derece dikkatli bir kesti. Düz film yüklü İlaç (1 mm) deneysel işlemin bir parçası olarak (kaudal) aşağı konabilir. Özgün yönüne yerinden fasya ve adipoz doku konumlandırın. 8-0 rezorbe olmayanlar sütürler kullanılarak cilt insizyonu kapatın. Sonra gözlem altında hazırlanmış bir ısıtmalı kurtarma kafesteki fare yerleştirin ve ap yönetmekBöyle bupivakain, 0,02-0,05 ml% 0.25 lokal infiltrasyon olarak analjezik de temin. 2. In situ Spinotrapezius intravital Mikroskopi, % 3-4 izofluran 3-4 L'lik bir akış hızı-dk -1% 100 oksijen, buharlaşmış olan bir indüksiyon odasında fare anestetize. Enjekte edilebilir anestetiklerin ile daha az kardiyovasküler depresyon olduğundan, uçucu madde anestezi kullanılması, fonksiyonel ölçümleri için tercih edilir. Örneğin sodyum pentobarbital olarak mevcut değildir, uzun etkili enjektabl anestezikler, uçucu madde anestezi hayvan konumlandırılmış edildikten sonra tekrar enjeksiyonları önlemek için tercih edilir ise. Bir kez anestezi, sürekli bakım konsantrasyonları (genelde ~% 2) ve 0.5-1 L · dk -1 akış hızında bir anestezi maskesi (aka burun konisi) aracılığıyla izofluran teslim. Fare çoğunlukla kendi burun yoluyla havalandırılması, bu yüzden sadece başka yerde sınıflandırılmamış olanAnestezi maskesi diyafram ile burunlarını kapatmak için Gerekli veri. Gerekiyorsa, kırpma makası ve tüy dökücü krem ​​kullanarak arkasından saç kaldırmak. Isı pad hayvan taşıyın. Soğuk-bağlı vazokonstrüksiyon önlemek için euthermic durumda fareler korumak için önemli olduğunu, bu lambalar aracılığıyla gerçekleştirilebilir, su ısı pedleri dolaşan, mikrodalga yastıkları, vb ısıtır Rektal ısı probu yerleştirin ve 35 termo-kontrolörü set ° C. Iris makas ve standart desen forseps kullanarak spinotrapezius en kaudal sonunda cilt kesi olun. , Yağ yastığı için kraniyale kesi uzatın bir at nalı kesi oluşturma ve kuruma önlemek için plastik wrap ile flep kapsamaktadır. Görünürlüğünü maksimize etmek için forseps ve yaylı makas ile cilt altı bağ dokusu teşrih Blunt. Yakın toge gibi uyarıcı elektrotlar yerleştirinmümkün gibi termik olarak, mevcut alanın boyutunu küçültmek ve omurga için sadece yanal maruz kas kuyruk sonunda yerleştirmek için. 1 Hz teslim 200 μsec süresi, 2 mA amplitüdlü, kare dalgalar ile, bir elektrot veri toplama sistemi, elektrot uyaran izolatör ve bilgisayar denetleyicisi kullanarak elektrot yerleşimini doğrulamak için bir test stimülasyonu gerçekleştirin. Kuruma önlemek için maruz kası üzerinde plastik wrap yerleştirin. Damar çapları muvazene alacağı bir 30 dakika süre zamanlama başlayın. Vasküler mimari görüntülemek için spinotrapezius kası üzerinde intravital mikroskop yerleştirin. Immersiyon objektif kullanıyorsanız, objektif ve plastik wrap ile PBS bir damla yerleştirin. Ana arteriyol (büyük damar görünür) Yukarıdaki başlayan faiz gemi bulmak için XY düzleminde sahne işlemek. Küçük arteriol görselleştirmeyansıyan ışık mikroskobu ile es-kırmızı hücre sütun tarafından sağlanan daha fazla kontrast gerektirir. Biz öncelikle mikrovasküler kontrastı arttırmak için bir yan-akım karanlık alan mikroskobu görüntüleme kullanabilirsiniz, ancak kontrast da yüksek molekül ağırlıklı floresan dekstran intravenöz enjeksiyonundan sonra bir yansıyan ışık floresan mikroskop ile geliştirilebilir. 30 dakika dengelenme sonra, ilgilenilen damarın bir görüntü / video yakalama. 90 saniye için 8 Hz, teslim 200 μsec süresi, 2 mA genlik, yukarıda tanımlandığı gibi, bir kare dalgalar ile kas teşvik. Başka bir görüntü / video hemen sonrası stimülasyon Yakalama ve damar dinlenme çapı dönene kadar her dakika yakalamak için devam ediyor, 10 dk ~. Kontralateral kas kullanarak adımları 6-18 tekrarlayın. Veri analizi görüntü analiz yazılımı ile video kaliperler veya off-line ile gerçek zamanlı olarak yapılabilmektedir. Fareyi takip Euthanizeing IACUC protokolü. 3. Spinotrapezius Doku Hasat ve Fiksasyon Spinotrapezius Besleme ligasyonu adım 1 'deki gibi formülasyon; intraperitonal enjeksiyon yoluyla fareler anestetize. Iris makas ve standart desen forseps kullanarak fare kürek kemikli öne kranial bir kesi birkaç milimetre olun. Her iki yanal tarafta kaudal ve ensizyon genişletir. Cildi nazikçe yansıtan ve yüzeysel fasya keserek dorsal gövdesinden cildi serbest bırakın. Standart forseps kullanarak dorsal adipoz doku kaldırmak ve sonra kas yansıtacak ve benzer ventral adipoz doku teşrih künt diseksiyon kullanın. Forseps ve yaylı makas kullanılarak kas örten fasya çıkarın. Bu adım, zor ve zaman alıcı olabilir, ama immünofloresan boyama ve görüntüleme artırmak için önemli olabilir. Doku sulu tutulması fasya kaldırılmasını kolaylaştırabilir. YerleştirmekLateral kas sınır ve ventral yatıyor yağ yastığı gelen spinotrapezius kas ayırmak için künt diseksiyon kullanabilirsiniz. Kaudal yönde bir Kranyal künt diseksiyon devam edin. Birçok kan damarları bu durum kas ventral yüzeyi girip terk unutmayın; perfüzyon gerekli ise, bu kapların transecting önce yapılmalıdır. Bu kas kaudal yarısında, lateral sınır ekler ventral yalan kas içine unutmayın. Bazı kesim tamamen kenar tanımlamak ve serbest bırakmak için bu sınır boyunca gerekli olabilir. Tüketim spinotrapezius kas. Bunu yapmak için: Serbest yukarıda tarif edildiği gibi kas yanal kenarı. Kas en kranial ölçüde boyunca enine kesin. Sagital planda, medial sınır (omurga boyunca) boyunca kesin. Tekrar prosedürü kontralateral kas 4-9 adımları yineleyin ve sonra m euthanizeBir IACUC onaylanmış yöntemi ile ouse. Soğutulmuş metanol (4 ° C) ya da 20 dakika için% 4 paraformaldehit / oda sıcaklığında deiyonize su çözeltisi ile daldırma yoluyla jelatin kaplı cam slaytlar üzerine doku düzeltildi. Alternatif olarak, perfüzyon fiksasyon istihdam edilebilir. 2. adıma önce, 1, 5 ml × 4 5 ml ardından, 0.1 mM CaCl2 ve sol ventrikül ile% 2 heparin ile salin Tris tamponlu ile sağ atrium bir kesi yapmak, bir torakotomi gerçekleştirmek ve perfuse damar % damar tespiti için paraformaldehit ve 1 sonunda 5 ml x 0.1 mM CaCl2 ile 7 Tris-tamponlu salin. Hemen sonra fiksasyonu, dört kez, 20 dakika boyunca numune yıkama her biri% 0.1 saponin ile, 0.01 M fosfat-tamponlu salin (PBS) ile.