Мышиные Spinotrapezius модели для оценки воздействия артериол Лигирование на микрососудистой функции и ремоделирования

1. Spinotrapezius поток артерии Лигирование хирургии Anesthetize мышь внутрибрюшинного введения. В 0,5 мл шприц, сформулировать: 0,06 мл 100 мг / мл кетамина 0,03 мл 20,0 мг / мл Ксилазин 0,01 мл 0,4 мг / мл атропина 0,30 мл 0,9% физиологического раствора. Доза: 0,01 мл * на грамм массы тела, IP- * Доза переменной при деформации мыши и акции, настроить соответствующим образом, мышь восстановления в течение часа с индукцией. Нанесите мазь стандартных офтальмологических, чтобы предотвратить высыхание роговицы. Удалить волосы назад с помощью обрезки ножницами, а затем краткое применение крема для удаления волос. Лечить операционного поля с хлоргексидина или повидон-йод. Альтернативный повидон-йод с этанолом в три раза, заканчивая повидон-йод. Перенесите мышью на предварительно подготовленную поверхность хирургической работе, с грелки и стерильная салфеткана место. Создание линейного разреза (3-5 мм) через спинной кожи около 5 мм каудально по отношению к костной известность лопатки использованием радужной оболочки ножницами и щипцами стандартного образца (например, FST, 11271-30) по палаток ткани и резки параллельно позвоночник. На сайте целевой разрез может быть идентифицирован по трансдермальных визуализации спинного жировой ткани, если позволяет пигментации кожи; сократить на хвостовом границы жировой ткани. Развернуть разрез по мере необходимости, и проходят через вторичные слои кожи с помощью пружинных ножниц. Анатомические записки – spinotrapezius мышц лежит сверху и простирается от T4 до L3 по обе стороны от позвоночника. Передняя граница проходит в боковом примерно лопатки. Мышцы сужается в каудальном направлении, так что самое задней границы лежит медиальнее к переднему краю, и может лежать на одном уровне с позвоночником. Два жировых отложений Также важно отметить, прокладка непосредственно спинной и брюшной к spinotrapeziusмышцы к черепной половины. Воспаление в связи с разреза было показано, что не влияет на сосудистый ответ ремоделирования, как фиктивный перевязка операция не показали изменения в ремоделирования сосудистой spinotrapezius. Две пространственные факторы влияют на этот результат. Первый разрез удаляется на 5 мм в краниальном направлении из области интересов, где сосудистая реакция в мышцах, как правило, рассматривается. Кроме того, в месте разреза на спине кожа отделяется от места перевязки судна брюшной жировой ткани, которая лежит на верхней части черепа трети мышцы spinotrapezius. Промывать разрез с решением нагретой Рингер, чтобы предотвратить высыхание мышц. Применение вазодилататоров, таких как папаверин будет оказывать помощь в визуализации целевой артерии для перевязки. Под микроскопом рассечение, используйте щипцы, чтобы притупить рассекают и отделяют (но не удалить) спинной белые жировой ткани от основной MUSCУлар ткани для того, чтобы визуализировать сосудистую, как он входит и выходит spinotrapezius на ее боковой край. Найдите целевой артерии, которая наряду с одним или двумя парными венами, проходит через жировой ткани, что является вентральный к spinotrapezius на своем пути, чтобы боковые края мышцы. Эта артерия питает значительную часть хвостового половине мышцы, которая может быть подтверждена путем отражения и замены мышцы наблюдать путь артерий в мышцы. Целевые места для перевязки является сегмент артерии выхода брюшной жировой ткани и въезда в мышцах, и вполне доступно в этом регионе. Артерия-вена пара, возможно, придется аккуратно отделить от брюшной жировой ткани в этой области. Обратите внимание, что spinotrapezius подается несколько артерия-вена пар, в том числе судов, которые поперечной либо спинных и брюшных жировых отложений. Будьте осторожны, чтобы не нарушать этих судов. Многочисленные показатели могут быть использованы для различения артериииз вены. Один из лучших методов, чтобы мягко препятствовать кровотока с микрозонда и двигаться вверх по течению от мышц; поток не возобновится в артерии, пока препятствие не будет отпущена. Цвет также может быть использован, как стенок вен содержать беловатые оболочку из соединительной ткани, что артерии не хватает. Кроме того, можно рассмотреть диаметром до применения сосудорасширяющих как жил, как правило, больше по размеру. Артерии, как правило, в непосредственной близости от своих парных вен; использовать тупой диссекции с микрозонда и № 5 щипцы, чтобы изолировать около 5 мм сегменте, переходя микрозонда за артерию, и с помощью иглы, чтобы сделать больший разрыв в природном щель между артерией и веной. Это щель, через которую шов будет резьбой. Использование 10-0 однопоточных шва и держатель иглы месте перевязки вокруг подачи артерии (~ 70 мкм в диаметре) в направлении проксимального конца расчлененный сегменте использованием узлов хирурга. PlaCE дополнительные перевязки к дальнему концу расчлененный артерии сегмента, с достаточным расстояние между лигатурами, чтобы обеспечить перерезки артерии. Малом масштабе, связанные с spinotrapezius артерии кормов приводит к повышению хирургической трудности, по сравнению с перевязкой больших судна, таких как бедренная артерия. Неопытные врачи в частности будет иметь высокие темпы отрыв, случайное кровотечение, и другие хирургические осложнения. Особую озабоченность вызывает трудность определения и сокращения бесцветный артерии после потока были препятствия перед резки. По этим причинам размещения 2 лигатуры рекомендуется для тех, кто привык к процедуре, как хирург имеет визуальное руководство в поиске, где секут артерии, а также подтверждение разрез с готовностью наблюдается разделение на 2 лигатуры. Тем не менее, более опытный хирург может найти ни одной лигатуры достаточное тех пор, пока они в состоянии четковыявить и сократить артерии ниже лигатуры. Хотя этот метод снижает риск непреднамеренного никующие поблизости судно с резким шовного лигирования, она не лишена недостатков, в том числе повышенной сложности в подтверждении артерия перерезана. Убедитесь, перевязки, наблюдая за уменьшением притока крови (препятствует РБК колонки) вниз по течению от перевязки сайта (т.е. к мышце). Использование рассечение ножницами секут перевязанной артерии, между двумя лигатурами. Если только одна лигатура была помещена (11а), вырезать с крайней осторожностью в направлении вниз. Наркотиков подшипников скольжения пленки (1 мм) может быть помещен ниже по течению (каудально) в рамках экспериментальной процедуры. Переместите перемещенных фасции и жировой ткани в исходной ориентации. Закрыть разрез кожи использованием 8-0, не рассасывающиеся швы. Затем поместите мышь в подготовленную клетку с подогревом восстановление под наблюдение и управление APpropriate анальгетик, такой как бупивакаин, 0.02-0.05 мл 0,25% местной инфильтрации. 2. Spinotrapezius Прижизненная микроскопия, на месте Anesthetize мыши в индукции камеры с 3-4% изофлурана испаряется в 100% кислорода при скорости потока 3-4 л · мин -1. Использование ингаляционного наркоза является предпочтительным для функционального измерения, поскольку там меньше сердечно-сосудистой депрессии, чем с инъекционной анестезии. Если ингаляционный наркоз в недоступны, длительного действия инъекционных анестетиков, таких как пентобарбитала натрия предпочтительно, чтобы избежать повторных инъекций один раз животное было расположены. После наркоза, постоянно доставлять изофлуран через анестезии маска (так называемый носовой обтекатель) на поддержание концентрации (обычно ~ 2%) и расход 0.5-1 л · мин -1. Мыши преимущественно проветривать через носовые ходы, так это только включенные в другие группировкиEssary, чтобы покрыть свои носу с диафрагмой маски анестезии. При необходимости удалить волосы со спины использованием обрезки ножницами и депиляции кремом. Транспортировка животных на тепло площадку. Это важно для поддержания мышей в euthermic состояние, чтобы предотвратить холодную вызванной сужением сосудов, что может быть достигнуто путем ламп, вода, циркулирующая тепла колодки, микроволновой печи нагревается колодки, и т.д. Вставьте ректального датчика температуры и установите термо-контроллера до 35 ° C. Сделайте разрез кожи на хвостовом конце spinotrapezius использованием радужной оболочки ножницами и щипцами стандартным шаблоном. Расширить разрез краниально к жировой ткани, создавая разрез подковы, и покрывать кожный лоскут полиэтиленовой пленкой для предотвращения высыхания. Blunt рассекать ткани подкожной соединительной щипцами и весной ножницами, чтобы максимизировать видимость. Поместите стимулирующие электроды как можно ближе Togeтермо насколько это возможно, чтобы свести к минимуму размер текущего поля, и помещать их в каудальном конце мышцы подвергаются только сбоку от позвоночника. Выполните тест стимуляции для подтверждения размещения электродов использованием приобретения электрода данных системы, изолятор электрода стимул, и компьютер контроллером, с квадратной волны длительностью 200 мкс, 2 мА амплитуды, выступил с частотой 1 Гц. Поместите пластиковую обертку над открытыми мышц, чтобы предотвратить высыхание. Начала отсчета времени на 30 мин период в течение которого судно диаметром сравняет. Установите прижизненной микроскопии над spinotrapezius мышцы, чтобы просмотреть сосудистой архитектуры. При использовании погружении линзы, поместите каплю PBS между объективным и полиэтиленовой пленкой. Начиная над главным артериол (самое крупное судно видно), манипулировать этап в плоскости XY, чтобы найти судно интерес. Визуализация небольших артериолES с отраженной световой микроскопии требует большего контраста, чем это предусмотрено эритроцитов колонки. Мы в первую очередь использовать побочный поток темном поле микроскопа изображений для повышения микрососудистых контраст, но контраст также может быть улучшено с отраженного света флуоресцентным микроскопом после внутривенной инъекции с высокой молекулярной массой флуоресцентные декстрана. После 30-минутного уравновешивания, захват изображений / видео судна интересов. Стимулировать мышц с квадратной волны длительностью 200 мкс, 2 мА амплитуды, поставляется в 8 Гц, в течение 90 сек, как описано выше. Захват другое изображение / видео сразу после стимуляции и продолжают снимать каждую минуту, пока судно не вернулись в покое диаметра, ~ 10 мин. Повторите шаги 6-18 использовании противоположной мышцы. Анализ данных может быть выполнена в режиме реального времени с видео суппортами или офф-лайн с изображением программного обеспечения для анализа. Усыпить мышь следитьING IACUC протокол. 3. Spinotrapezius Harvest тканей и фиксация Anesthetize мышей внутрибрюшинного введения; формулировка, как и в Spinotrapezius поток артерии Лигирование шаг 1. Сделайте надрез на несколько миллиметров краниально к костной известность лопатки мыши, используя диафрагму ножницами и щипцами стандартного шаблона. Развернуть разрез сбоку, а затем каудально с обеих сторон. Освободите кожу от спинного туловище, слегка отражающий кожи и сокращения поверхностной фасции. Используйте тупой диссекции, чтобы удалить спинной жировой ткани с использованием стандартных щипцов, а затем отражать мышц и анализировать аналогичным вентральной жировой ткани. Удалить фасции покрывающей мышцы с помощью пинцета и ножниц весной. Этот шаг может быть трудно и отнимает много времени, но важно улучшить иммунофлуоресцентного окрашивания и обработки изображений. Хранение тканей гидратированных может облегчить удаление фасции. Обнаруживатьбоковые границы мышцы, и использовать тупой диссекции отделить spinotrapezius мышцы от жировой ткани, которая лежит вентрально к нему. Продолжить тупой диссекции в головы к хвосту направлении. Отметим, что несколько сосудов въезжать и выезжать из этого вентральной поверхности мышцы, если перфузия, оно должно быть выполнено до пересекающих эти сосуды. Отметим также, что в каудальной половины мышц, его боковые вставки границу в мышцы, находящейся вентральной к нему. Некоторые резки может потребоваться вдоль этой границы, чтобы полностью определить и освободить края. Акцизный spinotrapezius мышцы. Для этого: Бесплатные бокового края мышцы, как описано выше. Сокращение поперечно наиболее черепно степени мышцы. Разрежьте вдоль медиальной границей (вдоль позвоночника), в сагиттальной плоскости. Повторите процедуру 4-9 шагов на противоположной мышцы, а потом усыпить мУз по IACUC утвержденного метода. Исправить тканей на покрытые желатином предметные стекла путем погружения в охлажденным метанолом (4 ° C) или в 4% параформальдегид / деионизированной водном растворе при комнатной температуре в течение 20 мин. Кроме того, перфузии фиксации могут быть использованы. До шагу 2, выполнить торакотомия, сделать разрез в правом предсердии, и заливать сосудистую с 5 мл 1 × трис-буферном растворе с 0,1 мМ CaCl 2 и 2% гепарина через левый желудочек, затем по 5 мл 4 % параформальдегидом для фиксации судна, и, наконец, 5 мл 1 × трис-буферном растворе с 0,1 мМ CaCl 2 7. Сразу же после фиксации, мыть образец четыре раза в течение 20 минут каждый с использованием 0,01 М фосфатным буферным раствором (PBS) с 0,1% сапонина.