Modelo Spinotrapezius murino para avaliar o impacto da ligadura arteriolar em função microvascular e Remodelação

1. Alimentação Spinotrapezius cirurgia de ligadura da artéria Anestesiar rato por injecção intraperitoneal. Em uma seringa de 0,5 ml, formular: 0,06 ml de 100 mg / ml Ketamine 0,03 ml de 20,0 mg / ml Xilazina 0,01 ml de 0,4 mg / ml de atropina 0,30 ml de solução salina a 0,9%. Dose: 0,01 * ml por grama de peso corporal, ip * Dose variável sobre tensão mouse e estoque, ajuste de acordo para recuperação do mouse está dentro de uma hora de indução. Aplicar pomada oftálmica padrão para evitar a dessecação da córnea. Remover o cabelo da parte de trás usando cortadores de corte, seguido pela aplicação breve creme depilatório. Desinfectar o campo cirúrgico com clorexidina ou iodo povidona. Alternate povidona-iodo com etanol três vezes, terminando com povidona-iodo. Transferir o mouse para a superfície de trabalho previamente preparado cirúrgico, com almofada de aquecimento e bata estérilno lugar. Criar uma incisão linear (3-5 mm), através da pele dorsal de aproximadamente 5 mm caudal para a proeminência óssea da omoplata utilizando tesouras e pinças íris padrão padrão (por exemplo, FST, 11271-30) por tenting o tecido e corte paralelo ao coluna. O local de incisão alvo pode ser identificado através da visualização transdérmica da almofada de gordura dorsal que permite pigmentação da pele; cortado na borda caudal da camada de gordura. Expandir a incisão, se necessário, e estender através de camadas secundárias da pele, usando uma tesoura de mola. Nota anatómica – O músculo spinotrapezius reside dorsalmente e estende-se a partir de T4 para L3 ao longo de cada lado da coluna vertebral. A borda anterior estende-se lateralmente para aproximadamente a omoplata. O músculo afunila na direcção caudal, de modo que a borda mais posterior medial está à borda anterior, e pode fixar nivelada com a coluna vertebral. Duas almofadas de gordura são também importante notar, colocando diretamente dorsal e ventral aos spinotrapeziusmúsculo para a metade do crânio. Inflamação devido à incisão tem sido demonstrado que não têm qualquer efeito sobre a resposta de remodelação vascular, tal como a cirurgia sham ligadura não mostraram alteração na remodelação da vasculatura spinotrapezius. Dois fatores espaciais contribuem para este resultado. Primeiro, a incisão é removido por 5 mm na direcção craniana da região de interesse, onde a resposta vascular no músculo é normalmente examinado. Além disso, o local de incisão na pele dorsal é separada do local de ligação vaso por uma almofada de gordura abdominal, que se situa na parte superior do terceiro par craniano do músculo spinotrapezius. Irrigar a incisão com solução de Ringer aquecido para evitar a dessecação do músculo. Aplicação de vasodilatadores tais como papaverina irá ajudar a visualização da artéria alvo para ligação. Sob um microscópio de dissecação, utilize uma pinça para neutralizar dissecar e separar (mas não remova) o almofada branca de gordura dorsal do musc subjacenteular tecido, a fim de visualizar o sistema vascular, uma vez que entra e sai da spinotrapezius no seu bordo lateral. Localizar o alvo da artéria, a qual, juntamente com um ou dois pares de nervuras, passa através da almofada de gordura que é ventral com as spinotrapezius sobre o seu caminho para a borda lateral do músculo. Esta artéria alimenta uma porção substancial da metade caudal do músculo, o que pode ser confirmado pela reflexão e substituindo o músculo para observar o trajecto da artéria dentro do músculo. O local alvo para a ligadura é o segmento da artéria que sai do bloco ventral gordura e entrarem no músculo, e é bastante acessível nesta região. A par da artéria venosa pode precisar de ser ligeiramente separada da almofada ventral gordura nesta região. Note-se que o spinotrapezius é alimentado por vários pares de artéria veia, incluindo os recipientes que transversais tanto as almofadas de gordura dorsal e ventral. Tome cuidado para não perturbar estas embarcações. Múltiplos indicadores podem ser utilizados para distinguir artériaa partir da veia. Um dos melhores métodos é gentilmente obstruir o fluxo de sangue com a microssonda e mover a montante longe do músculo, o fluxo não será retomada na artéria até que a obstrução é liberado. A cor pode também ser utilizada, como as paredes das veias conter uma bainha esbranquiçada do tecido conjuntivo que as artérias não possuem. Além disso, pode-se considerar o diâmetro antes da aplicação do vasodilatador como veias são tipicamente maiores em tamanho. A artéria é, tipicamente, na proximidade de sua veia emparelhado; usar dissecção romba com uma microssonda e # 5 fórceps para isolar um segmento de cerca de 5 milímetros, passando a microssonda atrás da artéria, e usando a ponta para fazer uma grande diferença no natural fenda entre a artéria e veia. Esta é a distância através da qual a sutura vai ser enfiada. Usando fio de sutura 10-0 único lugar o suporte de agulha e uma ligadura em torno da artéria de alimentação (~ 70 um de diâmetro) para a extremidade proximal do segmento dissecadas de nó de um cirurgião. Place uma ligação adicional para a extremidade distal do segmento da artéria dissecada, com uma separação suficiente entre as ligaduras para permitir a transecção da artéria. A escala pequena associada com a alimentação de artéria spinotrapezius conduz a uma maior dificuldade cirúrgica, em comparação com a ligação de um grande vaso, como a artéria femoral. Cirurgiões inexperientes particularmente terá altas taxas de avulsão, hemorragia inadvertido, e outras complicações cirúrgicas. De preocupação particular é a dificuldade de identificar e cortar a artéria incolor após o fluxo tem sido impedida, pouco antes do corte. Por estas razões, colocando duas ligaduras é recomendado para aqueles acostumados ao processo, como o cirurgião tem uma guia visual na localização onde a transecção da artéria, bem como uma confirmação do corte com a separação facilmente observáveis ​​das duas ligaduras. No entanto, um cirurgião mais experiente pode localizar uma ligadura única suficiente, desde que eles sejam capazes de claramenteidentificar e cortar as artérias jusante da ligadura. Embora esta técnica reduza o risco de inadvertidamente nicking um vaso próximo com a sutura de ligação acentuada, não é isenta de inconvenientes, incluindo o aumento da dificuldade em confirmar a artéria foi seccionada. Verificar a ligação ao observar diminuição do fluxo de sangue (RBC obstruído coluna) a jusante do local de ligação (isto é, no sentido do músculo). Usando tesouras de dissecação da artéria transect ligado, entre as duas ligaduras. Se apenas uma ligadura foi colocada (11), cortado com extremo cuidado no sentido de jusante. Droga carregada película lisa (1 mm), pode ser colocado a jusante (caudalmente) como parte do procedimento experimental. Reposicionar a fáscia deslocados e tecido adiposo para sua orientação original. Feche a incisão na pele usando 8-0 não-reabsorvíveis suturas. Em seguida, coloque o rato em uma gaiola de recuperação preparado aquecida sob observação e administrar um appriado analgésica tais como a bupivacaína, 0,02-0,05 ml de 0,25% de infiltração local. 2. Spinotrapezius microscopia intravital, in situ Anestesiar o rato numa câmara de indução com 3-4% de isoflurano vaporizado em 100% de oxigénio a um caudal de 3-4 L · min -1. O uso de anestesia por inalação é preferível para medidas funcionais, porque há menos depressão cardiovascular do que os anestésicos injectáveis. Se a anestesia por inalação, em que não estão disponíveis, de acção prolongada anestésicos injectáveis, tais como pentobarbital de sódio são preferidos para evitar injecções repetidas uma vez que o animal tenha sido posicionada. Uma vez anestesiados, continuamente entregar isoflurano através de uma máscara de anestesia (cone do nariz aka) em concentrações de manutenção (geralmente ~ 2%) e taxa de fluxo de 0,5-1 L · min -1. Ratos predominantemente ventilar através das suas vias nasais, por isso, é apenas necessário para cobrir o nariz com o diafragma máscara de anestesia. Se necessário, remover o cabelo da parte de trás usando cortadores de corte e creme depilatório. Transporte do animal para o bloco de calor. É importante manter a ratos em estado euthermic para prevenir a vasoconstrição induzida pela fria, o que pode ser conseguido através de lâmpadas, almofadas de água de circulação de calor, microondas aquece almofadas, etc Insira a sonda de temperatura retal e definir termo-controlador para 35 ° C. Faça uma incisão na pele na extremidade caudal dos spinotrapezius usando tesouras e pinças íris padrão standard. Estender a incisão cranialmente para a almofada de gordura, criando uma incisão de ferradura, e cobrir o retalho de pele com filme plástico para evitar a dessecação. Blunt dissecar o tecido conjuntivo subcutâneo com uma pinça e tesouras de mola para maximizar a visibilidade. Coloque eletrodos estimulantes como toge pertother quanto possível, para minimizar o tamanho do campo de corrente, e posicioná-los na extremidade caudal do músculo exposta imediatamente lateral à coluna vertebral. Realize uma estimulação de teste para confirmar a colocação do eletrodo usando um eletrodo sistema de aquisição de dados, isolador de estímulo eletrodo, e controlador de computador, com ondas quadradas de duração mseg 200, 2 mA amplitude, entregue a 1 Hz. Coloque filme plástico sobre o músculo exposto de evitar a dessecação. Inicie o tempo de um período de 30 minutos, durante o qual os vasos do vai equilibrar. Posicione o microscópio intravital sobre o músculo spinotrapezius para ver a arquitetura vascular. Se estiver usando uma lente de imersão, coloque uma gota de PBS entre o objetivo eo plástico. Começando por cima da arteríola principal (o maior vaso visível), a fase de manipular no plano XY para localizar o vaso de interesse. Visualizando arteriol pequenaes com microscopia de luz refletida requer um maior contraste do que o previsto pela coluna de hemácias. Utilizamos principalmente um lado de fluxo de imagem de microscópio de campo escuro para melhorar o contraste microvascular, mas de contraste pode também ser melhorada através de um microscópio de luz refletida fluorescente após a injecção intravenosa de um elevado peso molecular fluorescente dextrano. Após o equilíbrio de 30 min, a captura de uma imagem / vídeo do vaso de interesse. Estimular o músculo com ondas quadradas de 200 mseg de duração, amplitude de 2 mA, entregue em 8 Hz, durante 90 segundos, tal como descrito acima. Capturar outro estímulo imagem / vídeo imediatamente pós e continuar a capturar cada minuto até navio voltou para o diâmetro de descanso, ~ 10 min. Repetir os passos 6-18 utilizando o músculo contralateral. A análise dos dados pode ser realizada em tempo real, com compassos de calibre de vídeo ou off-line com o software de análise de imagem. Euthanize o mouse seguiring IACUC protocolo. 3. Colheita de Tecidos Spinotrapezius e Fixação Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal da formulação, tal como no passo Spinotrapezius Ligadura Artéria alimentação 1. Faça uma incisão milímetros vários cranianos para a proeminência óssea da lâmina do rato ombro com uma tesoura de íris e pinças padrão standard. Expandir a incisão lateral e, em seguida, caudalmente em ambos os lados. Solte a pele do tronco dorsal suavemente refletindo a pele e corte da fáscia superficial. Use dissecção romba para remover o tecido adiposo dorsal utilizando fórceps padrão, e, em seguida, reflecte o músculo e tecido adiposo similarmente dissecar ventral. Remover fáscia que cobre o músculo usando fórceps e tesouras de mola. Este passo pode ser difícil e demorada, mas é importante para melhorar a coloração de imunofluorescência e de imagem. Manter o tecido hidratado pode facilitar a remoção da fáscia. Localizara borda lateral do músculo, e usar dissecção romba para separar o músculo spinotrapezius da almofada de gordura que se encontra ventral a ele. Continue a raspagem em um crânio com a direção caudal. Note-se que os vasos sanguíneos vários entram e saem desta superfície ventral do músculo; se a perfusão é necessária, deve ser realizada antes atravessa em estes navios. Note-se também que na metade caudal do músculo, as suas inserções de borda lateral no músculo deitado ventral a ele. Alguns de corte pode ser necessário ao longo desta fronteira para definir completamente e libertar a borda. Músculo do Imposto spinotrapezius. Para fazer isso: Livre da borda lateral do músculo, como descrito acima. Cortado transversalmente através extensão mais cranial do músculo. Corte ao longo da borda medial (ao longo da coluna vertebral), no plano sagital. Repita os passos 4-9 procedimento no músculo contralateral, e depois eutanásia do mouse por um método aprovado IACUC. Fixar os tecidos em lâminas de vidro revestidas com gelatina e por imersão em metanol arrefecido (4 ° C) ou num paraformaldeído a 4% / solução de água desionizada à temperatura ambiente durante 20 min. Em alternativa, a fixação de perfusão pode ser empregado. Antes do passo 2, realizar uma toracotomia, fazer uma incisão no átrio direito e na vasculatura perfundir com 5 ml de 1 × solução salina tamponada com Tris-com 0,1 mM de CaCl 2 e 2% de heparina, através do ventrículo esquerdo, seguida de 5 ml de 4 % de paraformaldeído para fixação do navio, e, finalmente, 5 ml de 1 × solução salina tamponada com Tris-com 0,1 mM de CaCl 2 7. Imediatamente a seguir a fixação, lavar espécime quatro vezes durante 20 minutos cada. Usando 0,01 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 0,1% de saponina