微小血管機能およびリモデリングに動脈結紮の影響を評価するためにネズミSpinotrapeziusモデル

1。 Spinotrapeziusフィード動脈結紮手術腹腔内注射することにより、マウスを麻酔。 100 mg / mlのケタミンの0.06ミリリットル：0.5 mlシリンジ、策定中で 20.0 mg / mlのキシラジンの0.03ミリリットル 0.4 mg / mlとアトロピンの0.01ミリリットル 0.9％生理食塩水の0.30ミリリットル。 用量：グラム体重当たり0.01ミリリットルの*は、ip マウスの回復が誘導から時間内に収まるようマウス株と株価時*線量変数は、それに応じて調整してください。 角膜の乾燥を防ぐために、標準の眼軟膏を適用します。 脱毛クリームの簡単なアプリケーションに続いて、トリミングバリカンを使用して、バックから髪を削除します。 クロルヘキシジンやポビドンヨードで手術野を消毒してください。ポビドンヨードで終わる、エタノールで3回ポビドンヨード代替。 加熱パッドと滅菌ドレープで、先に調製した外科的な作業面にマウスを移すに代わるものであること。 アイリスはさみや鉗子標準パターンを使用して肩甲骨の骨突出に尾約5mm（ 例えば 、FST、11271から30）はテンで背部皮膚を通して組織を線形切開（3-5 mm）を作成し、平行切断棘がある。ターゲットの切開部位は、皮膚の色素沈着が許せば背脂肪パッドの皮可視化によって特定されるかもしれません;脂肪パッドの尾国境でカット。必要に応じて切開を展開し、春のはさみを使用して、セカンダリの皮膚層を貫通している。 解剖学ノート – spinotrapezius筋肉が背側に位置し、背骨の両側に沿って、L3へのT4から延びている。前縁はほぼ肩甲骨に横方向に延びる。筋肉は最も後縁は前縁に内側に位置しており、背骨と揃う築くことができるように尾側方向に先細り。二つの脂肪パッドも注意することが重要であり、spinotrapeziusに直接背腹敷設頭蓋2分の1に向かって筋肉。 偽結紮手術はspinotrapezius血管系のリモデリングに変化は見られなかったような切開に起因する炎症は、血管リモデリング応答に影響を及ぼさないことが示されている。二つの空間的な要因がこの結果に貢献しています。最初の切開は筋肉内の血管反応は、典型的に検査され、関心領域から頭蓋方向に5mmによって除去される。また、背部皮膚の切開部位はspinotrapezius筋肉の頭蓋第三の上に位置して腹脂肪パッドによって血管結紮部位から分離されている。 筋肉の乾燥を防ぐために温めておいたリンゲル液で切開を灌漑。パパベリンなどの血管拡張剤の適用は、連結のための標的動脈を可視化するのに役立つ。 解剖顕微鏡下では、基礎となるMUSCから（削除せず）解剖を鈍らせると分離するために背の白い脂肪パッドを鉗子を使用それが入り、その外側縁にspinotrapeziusを離れると、血管系を可視化するために、ウラル組織。 1つまたは2つのペアになって静脈に沿って、筋肉の外側縁にで、その途中でspinotrapeziusに腹の脂肪パッドを通過する標的動脈の位置を確認します。この動脈は反射や筋肉内動脈の経路を観察するために筋肉を交換することによって確認することができる筋肉の尾半分の大部分を供給します。ライゲーションのためのターゲットの場所は動脈腹脂肪パッドを終了し、筋肉に入るのセグメントであり、この地域では非常にアクセスが可能です。動脈·静脈のペアが優しくこの地域で腹脂肪パッドから分離する必要があるかもしれません。 spinotrapeziusが横背と腹脂肪パッドのどちらかその船を含む、複数の動脈·静脈のペアによって供給されることに注意してください。これらの船舶を妨害しないように注意してください。 複数の指標が動脈を区別するために使用することができる静脈から。最善の方法の1つは優しくマイクロプローブで血液の流れを妨げると筋肉から上流に移動することです。閉塞が解除されるまでの流れは動脈内に再開されません。静脈の壁は動脈が欠けている結合組織の白っぽい鞘を含んでいるので色も、​​使用することができます。静脈は一般的にサイズが大きくなっているようにまた、一つは、血管拡張剤を塗布する前に直径を考慮することがあります。 動脈は、そのペア静脈に近接して、典型的には、動脈の後ろにマイクロプローブを通過し、自然で広いギャップを作るために先端を使用して、マイクロプローブと約5mmのセグメントを分離するために、第5鉗子で鈍的切開を使用動脈と静脈の間の裂け目。これは、縫合糸がスレッドに経由されるギャップである。 10から0シングルスレッド縫合糸と針ホルダー場所外科医の結び目を使用して、解剖セグメントの近位端に向かって送り動脈（〜70μmの直径）の周りのライゲーションを用いた。ナンプラー動脈の切断を可能にするために合字との間に十分な分離とCE解剖動脈セグメントの遠位端に向かって追加のライゲーション、。 spinotrapeziusフィード動脈に関連付けられた小スケールは、大腿動脈などの大きな血管の結紮に比べて増加した外科的困難につながる。経験の浅い外科医は特に剥離率の高さ、不注意による出血、他の手術の合併症を持つことになります。特に懸念されるのは、識別および流れはちょうど切削前に妨害された後に無色の動脈を切断することの難しさです。外科医は動脈だけでなく、2字の分離を容易に観察可能とカットの確認を横断する場所を見つけるのに視覚的なガイドを持っているとして、これらの理由から、2合字を配置すること、手​​続きに不慣れな方にお勧めです。しかし、より多くの経験豊富な外科医がいる限り、彼らは明らかにすることができるよう、十分な合字を見つけることができるリガチャーの動脈下流を識別し、カット。このテクニックは意図せずに鋭い結紮縫合糸に近い容器をニッキングのリスクを減少させている間、それは動脈が離断された確認の増加難しさを含む欠点がないわけではない。 下流ライゲーション部位（筋肉に向かってIE）の血流の減少（遮られたRBC列）を観察することにより、ライゲーションを確認します。 解剖用ハサミを使用するには、2つの合字の間にライゲートした動脈を横断する。唯一の1字が置かれていた場合（11a）は、下流方向に細心の注意を払ってカットします。 プレーンフィルム（1mm）を読み込ま薬は実験手順の一環として、（尾）の下流に配置されてもよい。 彼らの元の向きに変位筋膜と脂肪組織の位置を変更します。 8から0非吸収性縫合糸を用いて皮膚切開を閉じます。その後観察下準備温水回復ケージにマウスを置き、APの管理ブピバカイン、0.02〜0.05ミリリットル0.25パーセント局所浸潤などの鎮痛propriate。 2。 in situで Spinotrapezius生体顕微鏡、 3月4日、L·min -1の流速で100％酸素で気化イソフルラン3から4パーセントで誘導チャンバ内でマウスを麻酔。 注射麻酔薬よりも少ない心血管うつ病があるので、吸入麻酔の使用は、機能的な測定のために好適である。利用できないで吸入麻酔なら、そのようなペントバルビタールナトリウムとして長時間作用型の注射麻酔薬は、動物が配置された後に繰り返し注射を避けるために好ましい。 一度麻酔し、継続的にメンテナンス濃度（一般に約2％）と、0.5から1、L·min -1の流量で麻酔マスク（通称ノーズコーン）を通じてイソフルラン届ける。 マウスは、主に彼らの鼻の通路を通って換気するので、それが唯一のNECです麻酔マスクのダイヤフラムと鼻をカバーするessary。 必要であれば、トリミングバリカン及び脱毛クリームを使用して、バックから髪を削除します。 熱パッドに動物を輸送する。 低温誘導性の血管収縮を防ぐために適温の状態でマウスを維持することが重要であるが、これはランプ、水循環熱パッド、電子レンジで加熱パッド等を介して行うことができます直腸温度プローブを挿入し、35にサーモコントローラ℃に設定してください。 アイリスはさみと標準パターン鉗子を用いspinotrapeziusの尾側端で皮膚切開を加えます。 、脂肪パッドに頭側切開を延長馬の靴の切開を作成して、乾燥を防ぐためにラップで皮弁をカバーしています。 可視性を最大化するための鉗子と春のハサミで皮下結合組織を解剖鈍らせる。 近い峠として刺激電極を置き、できるだけ熱、現在のフィールドの大きさを最小限にし、脊椎へのちょうど横に露出筋肉の尾終わりにそれらを配置することができる。 1 Hzで配信さ200μ秒の持続時間、2ミリアンペア振幅の方形波で、電極のデータ集録システムは、電極刺激アイソレータ、およびコンピュータ·コントローラを用いた電極配置を確認するためのテスト刺激を行う。 乾燥を防ぐために露出した筋肉の上にラップを置きます。 血管径を平衡化される時に、30分の期間を計時開始。 血管構造を表示するためにspinotrapezius筋肉の上に生体顕微鏡を置きます。 浸レンズを使用する場合は、客観的かつプラスチックラップの間に、PBSを一滴。 主な動脈（可視最大の船舶）の上から始めて、興味のある容器を見つけるために、XY平面でステージを操作します。 小さなarteriolの可視化反射光顕微鏡でesは赤血球列が提供するよりもコントラストが必要です。当社は、主に微小血管のコントラストを高めるためにサイドストリーム暗視野イメージング顕微鏡を使用していますが、コントラストは、高分子蛍光デキストランを静脈内注射後の反射光蛍光顕微鏡で改善することができます。 30分間平衡化した後、目的の血管の画像/ビデオをキャプチャします。 上記のように、90秒間、200マイクロ秒の持続時間の方形波で8 Hzで配信2ミリアンペア振幅を、筋肉を刺激する。 別の画像/ビデオ直後の刺激をキャプチャして、血管が安静時直径に戻されるまで、毎分をキャプチャし続け、10分〜。 反対側の筋肉を使ってステップ6から18を繰り返します。 データ解析は、画像解析ソフトを用いてビデオキャリパーまたはオフラインでリアルタイムに行うことができます。 マウスが続く安楽死させるる動物実験委員会のプロトコル。 3。 Spinotrapeziusティッシュハーベストおよび固定腹腔内注射によりマウスを麻酔; Spinotrapeziusフィード動脈結紮のステップ1のように定式化。 アイリスはさみと標準パターン鉗子を用いて、マウスの肩甲骨の骨突出に頭蓋切開数ミリメートルを作る。両側尾次に横方向に切開を展開します。 優しく肌を反射し、浅筋膜を切断することによって、背胴から肌を解放します。 標準ピンセットを用いて背脂肪組織を除去した後、筋肉を反映しており、同様に腹の脂肪組織を切開する鈍的切開を使用しています。 鉗子と春のはさみを使用して筋肉を覆う筋膜を取り除きます。このステップでは難しく、時間がかかる場合がありますが、免疫蛍光染色とイメージングを向上させることが重要であることができます。組織が水和保つことは筋膜の除去を容易にすることができる。 見つける側筋の境界線、およびそれに腹側にある脂肪体からspinotrapezius筋肉を分離するために鈍的切開を使用しています。 尾側方向への頭蓋内の鈍的切開を続行します。いくつかの血管が筋肉のこの腹面に出入りすることに注意してください。灌流が必要な場合は、これらの血管をtransecting前に行われるべきです。その筋肉の尾側半分に、その外側縁を挿入それに腹を嘘筋肉にも注意してください。いくつかのカットは完全にエッジを定義し、解放するために、この境界に沿って必要な場合があります。 消費税​​spinotrapezius筋肉。これを行うには： 上記のような筋肉の外側縁無料。 筋肉のほとんどの頭蓋程度横切ってカットします。 矢状面において、内側縁（背骨に沿って）に沿って切り取ります。 反対側の筋肉にある手順の4から9を繰り返し、次に、mを安楽死させる動物実験委員会の承認された方法によってウーズ。 冷メタノールに浸漬（4℃）によって、または室温で20分間、4％パラホルムアルデヒド/脱イオン水溶液中のゼラチンコートしたスライドガラス上の組織を固定してください。 あるいは、灌流固定を採用してもよい。手順2の前に、1の5ミリリットル×4の5ミリリットル続く、0.1mMのCaCl 2および左心室を経由して2％のヘパリン生理食塩水、トリス緩衝と右心房に切開を行い、開胸を行い、灌流血管系％容器固定用パラホルムアルデヒド、最後に1の5ミリリットル×0.1 mMのCaCl 2 7と生理食塩水、トリス緩衝。 すぐに次の固定、4回20分間試料を洗う各0.1％サポニンと0.01Mのリン酸緩衝食塩水（PBS）を用いて行った。