Modello murino Spinotrapezius per valutare l'impatto della legatura arteriolare sulla funzione microvascolare e rimodellamento

1. Spinotrapezius feed Arteria Chirurgia legatura Anestetizzare topo mediante iniezione intraperitoneale. In una siringa da 0,5 ml, formulare: 0,06 ml di 100 mg / ml Ketamina 0.03 ml di 20,0 mg / ml Xylazina 0,01 ml di 0,4 mg / ml atropina 0,30 ml di soluzione salina allo 0,9%. Dose: 0.01 * ml per grammo di peso corporeo, ip * Dose variabile su ceppo di topi e stock, in modo da regolare di conseguenza il recupero del mouse si trova a un'ora da induzione. Applicare una pomata oftalmica di serie per prevenire l'essiccamento della cornea. Rimuovere i capelli dalla parte posteriore utilizzando Clippers taglio, seguito da breve applicazione di crema depilatoria. Disinfettare il campo chirurgico con clorexidina o polivinilpirrolidone-iodio. Alternate povidone-iodio con etanolo per tre volte, per finire con povidone-iodio. Trasferire il mouse sulla superficie precedentemente preparata lavoro chirurgico, con il rilievo di riscaldamento e telino sterilein posizione. Creare una incisione lineare (3-5 mm) attraverso la pelle dorsale circa 5 mm caudalmente alla prominenza ossea della scapola usando forbici iris e pinze modello standard (es. FST, 11.271-30) dalla tenda tessuto e taglio parallelo colonna vertebrale. Il sito di incisione di destinazione può essere identificato con la visualizzazione transdermico del cuscinetto dorsale grasso se i permessi di pigmentazione della pelle, tagliare al confine caudale del cuscinetto adiposo. Espandere l'incisione, se necessario, e si estendono attraverso gli strati cutanei secondari con le forbici a molla. Nota anatomica – Il muscolo spinotrapezius trova dorsalmente e si estende da T4 a L3 lungo entrambi i lati della colonna vertebrale. Il bordo anteriore si estende lateralmente a circa la scapola. Il muscolo si rastrema in direzione caudale in modo che il bordo più posteriore si trova medialmente al margine anteriore, e può fissare a filo con la spina dorsale. Due cuscinetti di grasso sono anche importante notare, posa direttamente dorsale e ventrale ai spinotrapeziusmuscolo verso la metà del cranio. Infiammazioni per l'incisione ha dimostrato di avere alcun effetto sulla risposta rimodellamento vascolare, come chirurgia legatura sham ha mostrato alcun cambiamento nel rimodellamento della vascolarizzazione spinotrapezius. Due fattori spaziali contribuiscono a questo risultato. Prima l'incisione viene rimosso da 5 mm in direzione craniale della regione di interesse in cui la risposta vascolare nel muscolo è tipicamente esaminato. Inoltre, il sito di incisione sulla pelle dorsale è separato dal sito legatura dei vasi da un pad ventrale grasso che si trova sulla sommità del terzo craniale del muscolo spinotrapezius. Irrigare l'incisione con la soluzione di Ringer riscaldata per prevenire l'essiccamento del muscolo. Applicazione di vasodilatatori come papaverina aiuterà a visualizzare l'arteria obiettivo per legatura. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare pinze per smussare sezionare e separare (ma non rimuovere) la dorsale bianco-pad grasso dal musc sottostantetessuto colare per visualizzare la vascolarizzazione, che entra ed esce dalla spinotrapezius sul suo bordo laterale. Individuare l'arteria bersaglio, che insieme con una o due coppie di vene, passa attraverso il cuscinetto di grasso che è ventrale alle spinotrapezius il suo cammino verso il bordo laterale del muscolo. Questa arteria alimenta una porzione sostanziale della metà caudale del muscolo, che può essere confermata da riflettere e sostituendo il muscolo di osservare il percorso dell'arteria all'interno del muscolo. La posizione di destinazione è il segmento legatura dell'arteria uscita dal pad ventrale grasso e immettendo il muscolo, ed è piuttosto accessibile in questa regione. L'arteria-vena coppia potrebbe essere necessario delicatamente separata dal pad ventrale grasso in questa regione. Si noti che il spinotrapezius è alimentata da molteplici arteria-vena coppie, comprese le navi che attraversano sia le pastiglie dorsali e ventrali di grasso. Fare attenzione a non interrompere questi vasi. Più indicatori possono essere utilizzati per distinguere arteriadalla vena. Uno dei metodi migliori è quello di ostacolare il flusso di sangue delicatamente con la microsonda e spostare a monte dal muscolo; flusso non riprenderà nell'arteria finché l'ostruzione viene rilasciato. Colore può anche essere usato, come pareti venose contengono una guaina biancastra di tessuto connettivo che mancano arterie. Inoltre, si può considerare il diametro prima dell'applicazione di vasodilatatore come vene sono tipicamente di dimensioni maggiori. L'arteria è tipicamente in prossimità della sua vena accoppiato; utilizzare scollamento con una microsonda e # 5 forcipe per isolare un segmento di circa 5 mm, passando la microsonda dietro l'arteria, e utilizzando la punta per fare un gap più ampio nella naturale fessura tra l'arteria e la vena. Questo è il varco attraverso il quale la sutura viene filettato. Utilizzando 10-0 sutura singolo filo e dell'ago segnaposto una legatura intorno all'arteria alimentazione (~ 70 micron di diametro) verso l'estremità prossimale del segmento sezionato utilizzando nodo di un chirurgo. Place un ulteriore legatura verso l'estremità distale del segmento dell'arteria sezionato, con separazione sufficiente tra legature per consentire transezione dell'arteria. La piccola scala associato con l'arteria alimentazione spinotrapezius porta a un maggiore difficoltà chirurgica, rispetto alla legatura di un vaso più grande, come l'arteria femorale. Chirurghi inesperti in particolare si hanno alti tassi di avulsione, emorragia involontaria, e altre complicanze chirurgiche. Di particolare interesse è la difficoltà di individuare e tagliare l'arteria incolore dopo che il flusso è stato impedito appena prima del taglio. Per queste ragioni, ponendo due legature è raccomandato per chi non sia la procedura, il chirurgo ha una guida visiva nel localizzare dove transetto l'arteria e la conferma del taglio con la separazione facilmente osservabili dei due legature. Tuttavia, un chirurgo più esperto può trovare una legatura singola sufficiente, purché siano in grado di chiaramenteindividuare e tagliare le arterie valle della legatura. Mentre questa tecnica riduce il rischio di intaccare involontariamente una nave vicina alla sutura legatura tagliente, non è priva di inconvenienti, tra cui difficoltà aumentata nel confermare l'arteria stato sezionato. Verificare legatura osservando diminuzione del flusso di sangue (RBC ostruito colonna) a valle del sito di legatura (cioè verso il muscolo). Usando forbici transetto dissezione dell'arteria ligato, tra le due legature. Se solo una legatura è stato posto (11a), tagliato con estrema cura nella direzione a valle. Droga caricato plain-film (1 mm) può essere posta a valle (caudalmente) come parte della procedura sperimentale. Riposizionare la fascia sfollati e tessuto adiposo per l'orientamento originale. Chiudere l'incisione cutanea con 8-0 punti di sutura non riassorbibili. Quindi posizionare il mouse in una gabbia preparata recupero riscaldato sotto osservazione e amministrare un apinappropriate analgesico come bupivacaina, 0,02-0,05 ml 0,25% infiltrazione locale. 2. Spinotrapezius microscopia intravitale, in situ Anestetizzare il mouse in una camera di induzione con 3-4% vaporizzato isoflurano in ossigeno al 100% ad una velocità di flusso di 3-4 L · min -1. L'uso di anestesia per inalazione è preferibile per misurazioni funzionali perché c'è minore depressione cardiovascolare che con anestetici iniettabili. Se l'anestesia inalatoria in non disponibili, anestetici iniettabili a lunga azione, come sodio pentobarbital sono preferiti per evitare iniezioni ripetute volta che l'animale è stato posizionato. Una volta anestetizzato, continuamente fornire isoflurano attraverso una maschera di anestesia (cono di aka) a concentrazioni di manutenzione (in genere ~ 2%) e il tasso di flusso di 0,5-1 L · min -1. Topi prevalentemente ventilare attraverso i loro passaggi nasali, quindi è solo ncasario per coprire il naso con il diaframma maschera anestesia. Se necessario, rimuovere i capelli dalla parte posteriore utilizzando cesoie taglio e crema depilatoria. Trasportare l'animale al pad calore. È importante mantenere topi in uno stato euthermic per evitare freddo indotta vasocostrizione, che può essere realizzato attraverso lampade, acqua circolante pastiglie di calore, riscalda microwavable pastiglie, ecc Inserire la sonda di temperatura rettale e impostare termo-regolatore a 35 ° C. Effettuare una incisione cutanea alla fine caudale dei spinotrapezius con le forbici iris e pinze dello stile internazionale. Estendere l'incisione cranialmente al cuscinetto adiposo, la creazione di una incisione ferro di cavallo, e coprire il lembo cutaneo con involucro di plastica per prevenire l'essiccamento. Blunt sezionare il tessuto connettivo sottocutaneo con pinze e forbici a molla per massimizzare la visibilità. Posizionare gli elettrodi stimolanti come toge vicinother possibile, per ridurre al minimo le dimensioni del campo corrente, e posizionarli all'estremità caudale del muscolo esposto appena lateralmente alla colonna vertebrale. Eseguire una stimolazione di prova per verificare il posizionamento degli elettrodi con un sistema di elettrodi di acquisizione dati, stimolo isolatore dell'elettrodo, e controller computer, con onde quadre di durata 200 msec, 2 mA ampiezza, consegnato a 1 Hz. Posizionare l'involucro di plastica sopra il muscolo esposto per prevenire l'essiccamento. Iniziare il cronometraggio un periodo di 30 minuti durante il quale i diametri dei vasi si equilibrano. Posizionare il microscopio intravitale sopra il muscolo spinotrapezius per visualizzare l'architettura vascolare. Se si utilizza un obiettivo a immersione, una goccia di PBS tra l'obiettivo e l'involucro di plastica. Partenza sopra l'arteriola principale (la più grande vaso visibile), manipolare la fase nel piano XY per individuare il vaso di interesse. Visualizzare piccolo arterioles con luce riflessa microscopio richiede un maggiore contrasto rispetto a quanto previsto dal rosso-cella della colonna. Si utilizzano principalmente un lato-stream microscopio a campo scuro imaging per migliorare il contrasto microvascolare, ma invece può essere migliorata con un microscopio a luce riflessa fluorescente dopo l'iniezione endovenosa di un elevato peso molecolare fluorescente destrano. Dopo i 30 minuti di equilibrio, acquisire un'immagine / video del vaso di interesse. Stimolare il muscolo con onde quadre di 200 psec durata, ampiezza 2 mA, consegnato a 8 Hz, per 90 secondi, come descritto sopra. Cattura un'altra immagine / video stimolazione immediatamente dopo e continuare a catturare ogni minuto fino nave è tornato al diametro di riposo, ~ 10 min. Ripetere i passaggi 6-18 utilizzando il muscolo controlaterale. L'analisi dei dati può essere eseguita in tempo reale con pinze video o off-line con il software di analisi delle immagini. Eutanasia seguire il mouseing IACUC protocollo. 3. Tissue Harvest Spinotrapezius e fissaggio Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale, come nella formulazione Spinotrapezius passo legatura dell'arteria alimentazione 1. Fai un millimetro di incisione più cranici alla prominenza ossea della scapola del mouse con le forbici iris e pinze dello stile internazionale. Espandere l'incisione lateralmente e caudalmente su entrambi i lati. Rilasciare la pelle dal tronco dorsale delicatamente riflettendo la pelle e tagliare la fascia superficiale. Utilizzare smussa per rimuovere il tessuto adiposo dorsale con pinze standard, e poi riflettere e allo stesso modo il muscolo sezionare il tessuto adiposo ventrale. Rimuovere fascia sovrastante il muscolo con pinze e forbici a molla. Questo passaggio può essere difficile e richiede tempo, ma è importante per migliorare immunofluorescenza e di imaging. Mantenendo il tessuto idratato può facilitare la rimozione della fascia. Individuareil bordo laterale del muscolo, e utilizzare smussa per separare il muscolo spinotrapezius dal cuscinetto adiposo che si trova ventrale ad esso. Continua la dissezione smussa in un cranio in direzione caudale. Si noti che i vasi sanguigni più entrare e uscire da questa superficie ventrale del muscolo; se perfusione è richiesto, dovrebbe essere eseguita prima sezionare questi vasi. Si noti inoltre che nella metà caudale del muscolo, gli inserti bordo laterale nel muscolo ventrale giace ad esso. Alcuni di taglio può essere richiesto lungo questo confine per definire completamente e liberare il bordo. Accise il muscolo spinotrapezius. Per fare ciò: Libera il bordo laterale del muscolo come descritto sopra. Tagliare trasversalmente misura più craniale del muscolo. Tagliare lungo il bordo mediale (lungo la colonna vertebrale), nel piano sagittale. Procedura Ripetere i passaggi 4-9 a muscolo controlaterale, e quindi l'eutanasia mOuse con un metodo IACUC approvato. Fissare i tessuti di gelatina rivestite vetrini per immersione in metanolo freddo (4 ° C) o in paraformaldeide 4% / soluzione di acqua deionizzata a temperatura ambiente per 20 min. In alternativa, la fissazione di perfusione può essere impiegato. Prima del punto 2, eseguire una toracotomia, fare un'incisione nell'atrio destro, vascolarizzazione e profumato con 5 ml di Tris 1 × soluzione salina tamponata con 0,1 mM CaCl 2 e 2% eparina attraverso il ventricolo sinistro, seguito da 5 ml di 4 % paraformaldeide per fissaggio vaso, e infine 5 ml di Tris 1 × soluzione salina tamponata con 0,1 mM CaCl 2 7. Immediatamente fissazione seguente, lavare campione quattro volte per 20 minuti ciascuno utilizzando 0,01 M tampone fosfato salino (PBS) con 0,1% saponina.