Murine Spinotrapezius Modell, um die Auswirkungen der Arteriolen Ligation auf mikrovaskuläre Funktion und Remodeling beurteilen

Ein. Spinotrapezius-Feed Artery Ligation Surgery Anästhesieren Maus durch intraperitoneale Injektion. In einer 0,5 ml-Spritze, formulieren: 0,06 ml 100 mg / ml Ketamin 0,03 ml 20,0 mg / ml Xylazin 0,01 ml von 0,4 mg / ml Atropin 0,30 ml einer 0,9% igen Kochsalzlösung. Dosis: 0,01 ml je Gramm * Körpergewicht, ip * Dose variable nach Mausstamm und Lager, entsprechend anzupassen, so Maus Erholung ist innerhalb einer Stunde nach Induktion. Übernehmen Standard-Augensalbe zur Hornhaut Austrocknung zu verhindern. Entfernen Sie Haare aus dem Rücken mit Trimmen Klipper, durch kurzzeitiges Anlegen Enthaarungscreme gefolgt. Desinfizieren Sie die OP-Feld mit Chlorhexidin oder PVP-Jod. Mögliche Povidonjod mit Ethanol dreimal, endend mit Povidon-Iod. Übertragen die Maus an den zuvor hergestellten chirurgischen Arbeitsfläche, mit Heizkissen und sterile Abdecktuchan Ort und Stelle. Erstellen Sie eine lineare Inzision (3-5 mm) durch die Rückenhaut ca. 5 mm kaudal der Knochenvorsprung des Schulterblattes mit Iris Schere und Standard-Muster Pinzette (zB FST, 11271-30) durch Zeltplanen das Gewebe und Schneiden parallel zur Wirbelsäule. Das Ziel Inzisionsstelle kann durch transdermale Visualisierung der dorsalen Fettpolster, wenn die Pigmentierung der Haut Genehmigungen identifiziert werden; geschnitten am kaudalen Rand der Fettpolster. Erweitern Sie den Schnitt nach Bedarf und erstrecken sich durch sekundäre Hautschichten durch Federkraft Schere. Anatomische note – Die spinotrapezius Muskel liegt dorsal und erstreckt sich von T4 bis L3 auf beiden Seiten entlang der Wirbelsäule. Der vordere Rand seitlich in etwa dem Schulterblatt. Der Muskel verjüngt im kaudalen Richtung, so dass die hinteren Rand medial liegt bis zum vorderen Rand und können vorsehen bündig mit der Wirbelsäule. Zwei fette Pads sind auch wichtig zu beachten, Verlegung direkt dorsalen und ventralen den spinotrapeziusMuskeln nach kranial Hälfte. Entzündung durch den Einschnitt hat sich gezeigt, keinen Einfluß auf die Reaktion haben Gefäßumbau als Schein Ligation Operation zeigte keine Änderung der Umbau des spinotrapezius Gefäßsystem. Zwei räumliche Faktoren tragen zu diesem Ergebnis. Zuerst wird durch den Einschnitt 5 mm in der kranialen Richtung von der interessierenden Region, wo die vaskuläre Reaktion im Muskel typischerweise untersucht wird entfernt. Zusätzlich wird die Einschnittstelle auf der Rückenhaut von dem Gefäß durch eine Ligationsstelle ventralen Fettpolster, die oben auf der kranialen Drittel des spinotrapezius Muskel liegt getrennt. Spülen Sie den Schnitt mit erwärmten Ringer-Lösung, um Muskeln Austrocknung zu verhindern. Anwendung Vasodilatatoren wie Papaverin in Visualisieren der Ziel-Arterie zur Ligation unterstützen. Unter einem Binokular, verwenden Pinzette stumpf sezieren und zu trennen (aber nicht entfernen) die dorsale weiß-Fettpolster aus dem zugrunde liegenden muscdere Gewebes, um die Vaskulatur visualisieren, wie es und gelangt verläßt den spinotrapezius auf seiner seitlichen Kante. Lokalisieren der Ziel-Arterie, die zusammen mit einer oder zwei gepaarten Venen, durchläuft die Fettpolster, die zu den ventralen spinotrapezius auf seinem Weg in dem seitlichen Rand des Muskels ist. Diese Arterie speist einen wesentlichen Teil des kaudalen Hälfte des Muskels, der durch Reflektieren und Ersetzen des Muskels, um den Pfad der Arterie innerhalb des Muskels zu beobachten bestätigt werden kann. Die Zielstelle für die Ligation ist das Segment der die Arterie Verlassen des ventralen Fettpolster und Eingabe des Muskels, und ist durchaus zugänglich in dieser Region. Die Arterie-Vene Paares müssen vorsichtig aus dem ventralen Fettpolster werden in diesem Bereich getrennt. Man beachte, dass die durch mehrere spinotrapezius Arterie-Vene-Paare gespeist wird, einschließlich der Schiffe, dass quer entweder die dorsalen und ventralen Fettpolster. Achten Sie darauf, diese Schiffe zu stören. Mehrere Indikatoren verwendet werden, um Arterien zu unterscheidenaus der Vene. Eine der besten Methoden ist, um sanft zu behindern den Blutfluss mit der Mikrosonde und bewegen Upstream vom Muskel; Förderstrom wird nicht in der Arterie wieder, bis das Hindernis freigegeben wird. Farbe kann auch verwendet werden, wie Venenwände eine weißliche Hülle aus Bindegewebe, Arterien fehlt enthalten. Ferner kann man den Durchmesser vor dem Auftragen von Vasodilator betrachten als Adern sind typischerweise größer. Die Arterie ist typischerweise in unmittelbarer Nähe zu seinem gepaarten Vene; verwenden stumpf mit einer Mikrosonde und # 5 Zange zu einer etwa 5 mm Segment zu isolieren, indem die Mikrosonde hinter der Arterie und mit der Spitze, um einen breiteren Spalt im natürlichen Make Kluft zwischen der Arterie und Vene. Dies ist der Spalt, durch den der Faden gefädelt werden. Verwendung 10-0 Single-Thread-Naht und Nadelhalter erfolgt eine Ligation um den Vorschub Arterie (~ 70 um Durchmesser) in Richtung des proximalen Endes des seziert Segment unter Verwendung eines Chirurgen Knoten. Place ein zusätzlicher Ligation zum distalen Ende des eingeschnittenen Arteriensegment mit ausreichender Trennung zwischen Ligaturen um Durchtrennung der Arterie zu ermöglichen. Die Kleinen mit der spinotrapezius Feed Arterie verbunden führt zu einer erhöhten operativen Schwierigkeiten, im Vergleich zu Ligation von einem größeren Schiff wie die Oberschenkelarterie. Unerfahrene Chirurgen besonders haben hohe Abriss, unbeabsichtigte Blutungen und andere chirurgische Komplikationen. Von besonderer Bedeutung ist die Schwierigkeit der Identifizierung und Schneiden des farblosen Arterie nach Flow hat gerade vor dem Schneiden behindert. Aus diesen Gründen wird Platzieren 2 Ligaturen für die ungewohnte dem Verfahren zu empfehlen, da der Chirurg eine visuelle Anleitung bei der Suche, wo die Arterie sowie eine Bestätigung der Schnitt mit dem leicht beobachtbar Trennung der 2 Ligaturen durchschneiden zu können. Jedoch kann ein erfahrener Chirurg finden eine einzige Ligatur ausreicht, solange sie in der Lage, eindeutigidentifizieren und schneiden die Arterie hinter der Ligatur. Während diese Technik reduziert das Risiko, ungewollt Nicking einen nahegelegenen Gefäßes mit der scharfen Ligation Nahtmaterial, ist es nicht ohne Nachteile, einschließlich der erhöhten Schwierigkeit bei der Bestätigung die Arterie durchtrennt wurde. Überprüfen Ligation durch Beobachten Verminderung der Durchblutung (RBC behindert Spalte) stromabwärts der Ligationsstelle (dh in Richtung des Muskel). Verwendung Präparierschere durchschneiden die ligierte Arterie, zwischen den zwei Ligaturen. Wenn nur eine Ligatur gelegt wurde (11a), mit äußerster Vorsicht in der stromabwärtigen Richtung zu schneiden. Wirkstoffbeladenen plain-Folie (1 mm) kann stromabwärts platziert werden (kaudal) als Teil des experimentellen Verfahrens. Positionieren Sie den Vertriebenen Faszie und Fettgewebe zu ihrer ursprünglichen Ausrichtung. Schließen Sie den Hautschnitt mit 8-0 nicht resorbierbaren Nahtmaterial. Dann legen Sie die Maus in eine vorbereitete beheizten Recovery Käfig unter Beobachtung und Verwaltung eines apchenden Analgetikum wie Bupivacain, 0,02-0,05 ml 0,25% lokale Infiltration. 2. Spinotrapezius Intravital Mikroskopie, in situ Anästhesieren die Maus in einer Ansaugkammer mit 3-4% Isofluran mit einer Flussrate von 3-4 L · min -1 von 100% Sauerstoff verdampft. Die Verwendung von Inhalat Anästhesie ist bevorzugt funktionelle Messungen, weil es weniger als kardiovaskuläre Depression mit injizierbaren Anästhetika. Wenn Inhalationstor Anästhesie in nicht verfügbar ist, langwirkende injizierbare Anästhetika, wie Natrium-Pentobarbital sind bevorzugt, um wiederholte Injektionen vermeiden wenn das Tier positioniert worden ist. Einmal betäubt, kontinuierlich zu liefern durch eine Narkosemaske (aka Bugspitze) Isofluran bei Wartung Konzentrationen (in der Regel ca. 2%) und Durchfluss von 0.5-1 L · min -1. Mäuse überwiegend durch ihre Nasengänge lüften, so ist es nur angEssary ihre Nase mit dem Narkosemaske Membran abdecken. Wenn nötig, entfernen Haare von hinten mit Trimmen Klipper und Enthaarungscreme. Transportieren Sie das Tier zum Heizkissen. Es ist wichtig, Mäuse in einem Zustand zu halten, um euthermic kälteinduzierten Vasokonstriktion zu verhindern, dies kann durch Lampen erreicht werden, zirkulierende Wasser Heizkissen, heizt Mikrowellentauglicher Pads usw. Legen Sie die rektale Temperatursonde und setzen Thermo-Controller bis 35 ° C. Machen Sie einen Hautschnitt am kaudalen Ende der spinotrapezius mit Iris Schere und Standard-Muster Pinzette. Erweitern Inzision kranial der Fettpolster, die Schaffung eines Hufeisens Einschnitt, und decken die Hautlappen mit Plastikfolie, um ein Austrocknen zu verhindern. Blunt sezieren die subkutane Bindegewebe mit einer Pinzette und Feder Schere, um die Sichtbarkeit zu maximieren. Zeigen stimulierenden Elektroden so nah together wie möglich, zur Minimierung der Größe des aktuellen Feldes und positionieren sie am kaudalen Ende des freiliegenden Muskel nur seitlich der Wirbelsäule. Führen Sie einen Test Stimulation Platzierung der Elektroden bestätigen Sie mit einer Elektrode Datenerfassungssystem, Elektrode Stimulus Isolator und Computer-Steuerung, mit quadratischen Wellen eines 200 usec Dauer, 2 mA Amplitude, bei 1 Hz geliefert. Zeigen Plastikfolie über dem freigelegten Muskel, um ein Austrocknen zu verhindern. Beginnen mit der Zeitmessung eine 30 min, während der Gefäßdurchmesser wird äquilibrieren. Positionieren Sie den intravital Mikroskop über dem spinotrapezius Muskel, um die vaskuläre Architektur zu sehen. Bei Verwendung eines Immersionslinse, einen Tropfen PBS zwischen der objektiven und der Plastikverpackung. Ausgehend oberhalb des Haupt Arteriole (der größte Behälter sichtbar), Manipulation der Stufe in der XY-Ebene, um das Gefäß von Interesse zu lokalisieren. Visualisierung kleinen arterioles mit Auflichtmikroskopie erfordert mehr Kontrast als von der rot-Zell-Säule vorgesehen. Verwendet werden vor allem ein Seitenstrom Dunkelfeld-Abbildungsvorrichtung Mikroskop mikrovaskulären Kontrast zu verbessern, aber Kontrast kann auch mit einem Auflicht-Fluoreszenzmikroskop nach der intravenösen Injektion eines hochmolekularen fluoreszierenden Dextran verbessert werden. Nach dem 30-min Äquilibrierung Aufnehmen eines Bildes / Video des Schiffes von Interesse. Stimulieren den Muskel mit Rechteckwellen von 200 us Dauer, 2 mA Amplitude, bei 8 Hz, für 90 sec. geliefert, wie oben beschrieben. Nehmen Sie ein anderes Bild / Video unmittelbar nach Stimulation und weiterhin jede Minute zu erfassen, bis Schiff in den Ruhezustand Durchmesser zurückgekehrt ist, ~ 10 min. Wiederholen Sie die Schritte 6-18 mit dem kontralateralen Muskel. Datenanalyse in Echtzeit mit Video Bremssättel oder off-line mit Bildanalyse-Software durchgeführt werden. Euthanize die Maus folgenten IACUC Protokoll. 3. Spinotrapezius Tissue Ernte und Fixation Anästhesieren Mäusen durch intraperitoneale Injektion; Formulierung nach Spinotrapezius Vorschub Arterienligation Schritt 1. Einen Einschnitt mehrere Millimeter kranial des Knochenvorsprung der Maus Schulterblatt mit Iris Schere und Standard-Muster Pinzette. Erweitern Sie den Schnitt seitlich und dann kaudal auf beiden Seiten. Lassen Sie die Haut von dorsal Oberkörper, indem Sie vorsichtig was die Haut und Schneiden der oberflächlichen Faszie. Verwenden stumpf nach dorsal Fettgewebe mit Standard-Pinzette entfernen, und dann spiegeln die Muskeln und ähnlich sezieren ventral Fettgewebe. Entfernen Faszie über dem Muskel mit einer Pinzette und Feder Schere. Dieser Schritt kann schwierig und zeitraubend sein, aber ist wichtig, Immunfluoreszenzfärbung und Bildgebung zu verbessern. Halten Sie das Gewebe hydratisiert kann zu erleichtern Entfernung der Faszie. Lokalisierender laterale Rand des Muskels, und verwenden Sie stumpfe den spinotrapezius Muskel von der Fettpolster, die ventral liegt es trennen. Fahren Sie mit der stumpfen Dissektion in einem kranial nach kaudal. Beachten Sie, dass mehrere Blutgefäße betreten und verlassen diese ventralen Oberfläche des Muskels, wenn Perfusion erforderlich ist, sollte es vor dem Durchschneiden diese Gefäße durchgeführt werden. Man beachte auch, dass in der kaudalen Hälfte des Muskels, seinen seitlichen Rand Einsätze in den Muskel liegenden ventralen darauf. Einige Schneiden kann entlang dieser Grenze benötigt werden, um vollständig zu definieren und befreien den Rand. Excise die spinotrapezius Muskel. Um dies zu tun: Die seitliche freie Rand des Muskels, wie oben beschrieben. Schneiden quer über des Muskels am weitesten kranial Umfang. Geschnitten entlang der medialen Rand (entlang der Wirbelsäule), in der Sagittalebene. Wiederholen Sie den Vorgang Schritte 4-9 auf der kontralateralen Muskel, und dann einschläfern die mouse von einem IACUC zugelassenen Methode. Fix die Gewebe auf mit Gelatine beschichteten Objektträger durch Eintauchen in Methanol gekühlt (4 ° C) oder in einer 4% Paraformaldehyd / deionisiertem Wasser-Lösung bei RT für 20 min. Alternativ kann Perfusionsfixierung eingesetzt werden. Vor Schritt 2, führen eine Thorakotomie, einen Einschnitt in den rechten Vorhof und perfuse Gefäßsystem mit 5 ml 1 × Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 mM CaCl 2 und 2% Heparin über die linke Herzkammer, gefolgt von 5 ml 4 % Paraformaldehyd Gefäß Fixierung, und schließlich 5 ml 1 × Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 mM CaCl 2 7. Unmittelbar nach Fixierung, Waschen Muster viermal für jeweils 20 min mit 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,1% Saponin.