Murine Spinotrapezius model om de invloed van arteriolaire Ligatie beoordelen op microvasculaire functie en Remodeling

1. Spinotrapezius Feed Artery Ligatie Chirurgie Verdoof de muis door intraperitoneale injectie. In een 0,5 ml injectiespuit formuleren: 0,06 ml van 100 mg / ml ketamine 0,03 ml van 20,0 mg / ml xylazine 0,01 ml van 0,4 mg / ml Atropine 0,30 ml 0,9% zoutoplossing. Dosis: 0,01 ml * per gram lichaamsgewicht, ip * Dosis variabele op muizenstam en voorraad, dienovereenkomstig aan te passen, zodat de muis herstel is binnen een uur van inductie. Breng standaard oogzalf om het hoornvlies uitdroging te voorkomen. Verwijder haar van de rug met behulp van knippen klippers, gevolgd door korte toepassing van ontharingscrème. Desinfecteer het chirurgische veld met chloorhexidine of povidon-jodium. Alternatieve povidonjood met ethanol drie keer, eindigend met povidonjood. Breng de muis om de eerder bereide chirurgische werkblad, met verwarming pad en steriel lakenop zijn plaats. Maak een lineaire incisie (3-5 mm) door de dorsale huid ongeveer 5 mm caudaal van de benige prominentie van het schouderblad met iris schaar en standaard patroon pincet (bijvoorbeeld FST, 11271-30) door tenting het weefsel en het snijden parallel aan de wervelkolom. Het doel incisie site kan worden geïdentificeerd door transdermale visualisatie van de dorsale vetkussentje als pigmentatie van de huid toelaat; gesneden op de caudale rand van het vet pad. Vouw de incisie als nodig is, en uit te breiden door middel van secundaire huidlagen met behulp van de lente schaar. Anatomische kennis – De spinotrapezius spier ligt dorsaal en strekt zich uit van T4 naar L3 langs weerszijden van de wervelkolom. De voorste rand strekt zich zijdelings tot ongeveer het schouderblad. De spier versmalt in de caudale richting zodat de dorsale rand mediaal ligt aan de voorste rand en kan liggen gelijk met de wervelkolom. Twee dikke pads zijn ook belangrijk om op te merken, het leggen direct dorsaal en ventraal van de spinotrapeziusspieren naar de craniale half. Ontsteking door de incisie is aangetoond geen effect op de vasculaire remodellering reactie als sham operatie ligatie toonde geen verandering in hermodellering van het spinotrapezius vasculatuur. Twee ruimtelijke factoren dragen bij tot dit resultaat. Eerst wordt de incisie wordt verwijderd door 5 mm in de craniale richting van het gebied waar de vasculaire respons in de spier kenmerkend onderzocht. Bovendien wordt de incisie op de dorsale huid gescheiden van het vaartuig ligatieplaats door een ventrale vetkussentje dat ligt bovenop de craniale derde van de spinotrapezius spier. Spoel de incisie met de oplossing verwarmd Ringer's om spieren uitdroging te voorkomen. Toepassing van vasodilatoren zoals papaverine zal helpen bij het visualiseren van de beoogde slagader voor ligatie. Onder een dissectiemicroscoop een tang om bot te ontleden en te scheiden (maar niet verwijderen) de dorsale witte vet pad van de onderliggende muscheid weefsel om de vasculatuur visualiseren als het binnenkomt en verlaat de spinotrapezius op de zijkant. Zoek de beoogde slagader, die samen met een of twee gepaarde aderen, passeert het vetkussentje die ventraal van de spinotrapezius op weg in de zijrand van de spier. Deze slagader voedt een aanzienlijk deel van de caudale helft van de spier, die kan worden bevestigd door het afwegen en het vervangen van de spieren om het pad van de slagader nemen in de spier. De doellocatie voor ligatie het deel van de slagader die uit de ventrale vetkussentje en die in de spieren, en is vrij toegankelijk in deze regio. De slagader-ader pair moeten voorzichtig worden gescheiden van de ventrale vetkussentje in deze regio. Merk op dat de spinotrapezius wordt gevoed door meerdere slagader-ader paren, met inbegrip van schepen die dwars ofwel de dorsale en ventrale vetkussentjes. Zorg ervoor dat u deze schepen verstoren. Meerdere indicatoren kunnen worden gebruikt om onderscheid slagadervan ader. Een van de beste methoden is om voorzichtig bloedstroom belemmeren de microprobe en weg stroomopwaarts bewegen van de spier; stroom wordt niet hervat in de slagader totdat de obstructie wordt losgelaten. Kleur kan ook worden gebruikt als vaatwanden bevatten witte omhulsel van bindweefsel dat slagaders missen. Verder kan men overwegen de diameter vóór de toepassing van vasodilator als aderen doorgaans groter. De slagader is typisch dicht bij de gekoppelde ader; stompe dissectie met een microprobe en # 5 forceps om een ​​ongeveer 5 mm segment isoleren, door het passeren van de microprobe achter de slagader en met de punt naar een grotere afstand in de natuurlijke make kloof tussen de slagader en ader. Dit is de opening waardoor de hechting wordt geregen. Met 10-0 enkeldraadse hechtdraad en naaldhouder plaats een ligatie in de voeding slagader (~ 70 urn diameter) naar het proximale uiteinde van het segment ontleed met een chirurg knoop. Place extra ligatie naar het distale uiteinde van de slagader ontleed segment voldoende scheiding tussen ligaturen zorgen voor doorsnijden van de slagader. De kleinschalige geassocieerd met de voeding spinotrapezius slagader leidt tot verhoogde chirurgische moeilijkheden tegen ligatie van een groter vat zoals de femorale arterie. Onervaren chirurgen in het bijzonder zullen hoge tarieven van avulsie, onbedoelde bloedingen en andere chirurgische complicaties. Van bijzonder belang is de moeilijkheid om en snij de kleurloze slagader na doorstroming is belemmerd net voor het snijden. Om deze redenen is het plaatsen van 2 ligaturen aangeraden voor gewend aan de procedure, omdat de chirurg een visuele in plaatsbepaling waarbij de slagader en een bevestiging van de snede met de gemakkelijk waarneembare scheiding van de 2 ligaturen doorsnijden. Echter kan een ervaren chirurg vindt een ligatuur voldoende, mits zij kunnen duidelijkidentificeren en snijd de slagader stroomafwaarts van de ligatuur. Hoewel deze techniek vermindert het risico van onopzettelijk een nabijgelegen knikken vaartuig met de scherpe ligatie hechting is niet zonder nadelen, zoals verhoogde moeilijkheid bevestiging van de arterie werd doorsneden. Controleer ligatie door het observeren vermindering van bloedstroom (verhinderd RBC kolom) stroomafwaarts van de ligatieplaats (dwz in de spier). Schaar doorsnijden met de geligeerde slagader tussen de ligaturen. Als er slechts een ligatuur werd geplaatst (11a), gesneden met uiterste zorg in stroomafwaartse richting. Geneesmiddel beladen plain-film (1 mm) kan worden geplaatst stroomafwaarts (caudaal) als onderdeel van experimentele procedure. Plaats de ontheemden fascia en vetweefsel naar hun oorspronkelijke stand. Sluit de huid incisie met behulp van 8-0 niet-resorbeerbare hechtingen. Plaats dan de muis in een voorbereide verwarmde herstel kooi onder observatie en het toedienen van een appropriate analgeticum zoals bupivacaïne, 0,02-0.05 ml 0,25% lokale infiltratie. 2. Spinotrapezius intravitale Microscopy, in situ Verdoven de muis in een inductiekamer met 3-4% isofluraan verdampt in 100% zuurstof met een debiet van 3-4 L · min -1. Het gebruik van inhalatie anesthesie voorkeur functionele metingen omdat er minder cardiovasculaire depressie dan met injecteerbare anesthetica. Als inhalatie verdoving niet beschikbaar, langwerkende injecteerbare anesthetica, zoals natriumpentobarbital de voorkeur aan herhaalde injecties voorkomen wanneer het dier is gepositioneerd. Eenmaal verdoofd, voortdurend isofluraan te leveren door middel van een verdoving masker (aka neuskegel) bij het ​​onderhoud concentraties (meestal ~ 2%) en het debiet van 0,5-1 L · min -1. Muizen voornamelijk ventileren door middel van hun neus, dus het is alleen negessary om hun neus te bedekken met de narcose masker middenrif. Verwijder indien nodig haar van de rug met behulp van knippen clippers en ontharingscrème. Vervoer het dier om de warmte pad. Het is belangrijk om muizen in een euthermic toestand te houden om koude-geïnduceerde vasoconstrictie voorkomen, dit kan worden bereikt door lichten, water hete lucht pads, magnetron verwarmt pads, etc. Steek de rectale temperatuur probe en stel thermo-controller tot 35 ° C. Maak een incisie in de huid aan het caudale einde van de spinotrapezius met iris schaar en standaard patroon tang. Craniaal Verleng de incisie om het vet pad, het creëren van een hoefijzer incisie, en bedek de huid flap met plastic omslag om uitdroging te voorkomen. Blunt ontleden het onderhuids bindweefsel met een pincet en de lente schaar om de zichtbaarheid te maximaliseren. Plaats stimulerende elektroden zo dicht Together mogelijk de grootte van het huidige veld te minimaliseren en plaats ze op het caudale einde van het blootgestelde spier juist lateraal aan de wervelkolom. Voer een test stimulatie om plaatsing van de elektroden te bevestigen met behulp van een elektrode data-acquisitiesysteem, elektrode stimulus isolator, en computer controller, met vierkante golven van een 200 psec duur, 2 mA amplitude, geleverd met 1 Hz. Plaats plastic folie over de blootliggende spieren om uitdroging te voorkomen. De tijdsduur van een 30 min periode waarin het vaartuig diameters zal evenwicht. Plaats de intravitale microscoop over de spinotrapezius spier aan de vasculaire architectuur te bekijken. Als u een immersie lens, plaats een druppel PBS tussen de doelstelling en de plastic verpakking. Starten van boven de belangrijkste arteriole (het grootste schip zichtbaar), manipuleren van de fase in het XY-vlak naar het schip van belang vinden. Visualiseren kleine arterioles met gereflecteerd licht microscopie vereist meer contrast dan door de rode cel kolom. We gebruiken primair een zijstroom dark-field imaging microscoop microvasculaire contrast, maar ook het contrast kan worden verbeterd met een gereflecteerd-licht fluorescentiemicroscoop na de intraveneuze injectie van een hoog molecuulgewicht fluorescent dextran. Na de 30-min evenwicht, het nemen van een foto / video van het schip van belang. Stimuleren spier met blokgolven van 200 psec duur 2 mA amplitude leveren op 8 Hz, gedurende 90 sec, zoals hierboven beschreven. Leg een ander beeld / video direct na stimulatie en blijven elke minuut vast te leggen tot het schip is teruggekeerd naar de rustdiameter, ~ 10 minuten. Herhaal stap 6-18 via de contralaterale spier. Data analyse kan worden uitgevoerd in real time video beugels of off-line met beeldanalyse software. Euthanaseren de muis te volgening IACUC protocol. 3. Spinotrapezius Tissue Oogst en fixatie Verdoven muizen door intraperitoneale injectie; samenstelling als in Spinotrapezius Feed Artery Ligatie stap 1. Maak een insnijding enkele millimeters craniaal van de benige prominentie van de schouder van de muis mes met iris schaar en standaard patroon tang. Vouw de incisie lateraal en caudaal aan beide zijden. Laat de huid van dorsale romp door voorzichtig als gevolg van de huid en het snijden van de oppervlakkige fascia. Stompe dissectie tot dorsale vetweefsel met standaard forceps verwijderen en vervolgens de spier geven en eveneens ontleden ventrale vetweefsel. Verwijder fascia bovenliggende de spier met behulp van een tang en de lente schaar. Deze stap kan moeilijk en tijdrovend zijn, maar is belangrijk voor het verbeteren immunofluorescentie kleuring en beeldvorming. Het houden van het weefsel gehydrateerd kunnen verlichten verwijdering van de fascia. Plaatsende laterale rand van de spier en stompe dissectie tot de spinotrapezius spier scheiden van het vet pad dat ligt ventrale aan. Ga verder met de stompe dissectie in een craniaal naar caudaal. Merk op dat een aantal bloedvaten in en uit dit ventrale oppervlak van de spier, als perfusie nodig is, dient te worden uitgevoerd voordat doorsnijden deze schepen. Merk ook op dat in de caudale helft van de spier, de laterale rand inserts in de spier liggende ventrale aan. Sommige snijden kan nodig zijn langs deze grens om volledig te definiëren en te bevrijden van de rand. Accijnzen de spinotrapezius spier. Om dit te doen: Vrije de zijrand van de spier zoals hierboven beschreven. Snijd dwars over de meeste craniale de spier mate. Snijd langs de mediale rand (langs de ruggengraat), in het sagittale vlak. Herhaal de procedure stappen 4-9 op de contralaterale spier, en dan euthanaseren de mouse door een IACUC goedgekeurde methode. Bevestig de weefsels op met gelatine beklede objectglaasjes door onderdompeling in gekoelde methanol (4 ° C) of in een 4% paraformaldehyde / gedeïoniseerd water oplossing bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Alternatief kan perfusiefixatie worden. Voorafgaand aan stap 2, doet een thoracotomie een insnijding in het rechter atrium en perfuseren vasculatuur met 5 ml 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1 mM CaCl2 en 2% heparine via de linker ventrikel, gevolgd door 5 ml van 4 % paraformaldehyde voor schip fixatie en tenslotte 5 ml van 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1 mM CaCl2 7. Onmiddellijk na fixatie, wassen specimen vier keer 20 min elk met 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% saponine.