Spinotrapezius نموذج الفئران لتقييم أثر ربط شريني ظيفة الاوعية الدموية الدقيقة وعلى إعادة عرض
Summary
ونحن يبرهن على وجود رواية نموذج ربط الشرايين في العضلات spinotrapezius الفئران، بما في ذلك إجراء خطوة بخطوة ووصف الأجهزة المطلوبة. وصفنا الجراحة وقياسات النتائج ذات الصلة المتعلقة إعادة عرض شبكة الأوعية الدموية وتوسع الأوعية الوظيفية باستخدام المجهر متحد البؤر intravital و.
Abstract
وspinotrapezius الفئران هو، وسطحية رقيقة العضلات الهيكلية الدعم الذي يمتد من T3 إلى L4، ويمكن الوصول إليه بسهولة عن طريق شق الجلد الظهرية. التشريح الفريد يجعل spinotrapezius مفيدة للتحقيق في الإصابة الدماغية وإعادة عرض الاوعية الدموية الدقيقة لاحقة. هنا، علينا أن نبرهن نموذج ربط تصلب في العضلات وspinotrapezius الفئران التي تم تطويرها من قبل فريق البحث ونشرت سابقا 1-3. لبعض سلالات الفئران الضعيفة، مثل الماوس BALB / ج، وهذا يخلق جراحة ربط موثوق الهيكل العظمي نقص تروية العضلات ويخدم كمنصة للتحقيق في العلاجات التي تحفز عودة التوعي. وأظهرت أيضا أساليب التقييم، بما في ذلك استخدام المجهر متحد البؤر intravital و. هي مناسبة تماما لspinotrapezius لدراسات التصوير بسبب هذه سهولة الوصول إليها (التشريح الظهرية السطحية) وركاكة النسبي (60-200 ميكرون). يمكن تركيبه عضلات الوجه spinotrapezius EN، وتيسيرتصوير كامل العضلات شبكات الاوعية الدموية الدقيقة دون باجتزاء النسيجية. وصفنا استخدام المجهر intravital للحصول على قياسات بعد إجراء توسع الأوعية الوظيفية، على وجه التحديد، فإن الزيادة في القطر arterilar نتيجة لتقلص العضلات. علينا أن نبرهن أيضا إجراءات الحصاد وإصلاح الأنسجة، تمهيدا المناعية اللازمة لدراسات واستخدام المجهر متحد البؤر.
Introduction
النماذج الحيوانية من نقص التروية المزمن هي أدوات قيمة للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية للأمراض الدماغية، مثل مرض الشريان المحيطي، مرض الشريان التاجي، والأمراض الدماغية الوعائية. في القوارض، كما هو الحال في البشر، وانسداد الشرايين يؤدي إلى إعادة عرض الهيكلي للشبكة الأوعية الدموية، بما في ذلك تخلق الشرايين والأوعية الدموية. في المرضى الأصحاء والشباب، وهذا يمكن أن يكون كافيا لإعادة عرض الأنسجة إنقاذ من الاصابة التي يسببها نقص التروية، ولكن شارك في حالة مرضية مثل السكري يمكن أن تضر بشدة إعادة عرض والانتعاش. فهم الآليات الكامنة والأحداث الأوعية الدموية إعادة عرض أمر ضروري لتطوير علاجات التي تحفز هذه العمليات عودة التوعي الذاتية.
حاليا، ربط الشريان الفخذي أو استئصال في hindlimb هو الأسلوب القياسي لدراسة نقص التروية المزمن الناجم عن إعادة عرض الأوعية الدموية في الحيوانات الصغيرة 4،5. تحليل القطر، والربط، وتفاعليةو microvessels التي تشكل شبكة الأوعية الدموية المصب من الشريان الفخذي ligated أمر صعب، ولكن نظرا لسمك العضلات. وقد وضعنا نموذجا ربط تصلب في العضلات الماوس spinotrapezius: ربط جانب واحد من الشريان الجانبي تغذية العضلات في هذه الظهرية استقرار 1. وspinotrapezius رقيقة نسبيا (60-200 ميكرون) وهي قابلة للالمناعية وجه EN لتقييم طوبولوجيا شبكة كاملة مع قرار وحيد الخلية، مما يسمح بإجراء فحص مفصل للأحداث إعادة عرض الأوعية الدموية في جميع أنحاء الأنسجة بالكامل. وspinotrapezius أيضا سطحية ويمكن الوصول إليها، وبالتالي يمكن ملاحظتها بسهولة سفنها بواسطة المجهر intravital، لتوصيف الفعال للتأثير إعادة عرض وربط تصلب الأوعية الدموية على التفاعل.
في هذا التقرير، ونحن تصف بالتفصيل وشرح ربط الماوس شريني spinotrapezius النموذج. سواء في الجسم الحي وخارج الجسم الحي ليويرد وصف لعملية جراحية تقييم thods التالية، بما في ذلك قياس توسع الأوعية الوظيفية، وهو ما ثبت قد انخفضت في ظل ظروف نقص تروية 6، والتصوير مناعي شبكات الاوعية الدموية الدقيقة كامل العضلات. نحن تشمل أيضا نتائج دراستين منفصلتين رائدة للتدليل على فائدة هذا النموذج. أولا، نحن تستخدم نموذج ربط الشرايين للحث على زيادة ذات دلالة إحصائية في تعرج السفن في C57BL / 6 الفئران (الشكل 2B). زيادات تعرج أثناء تخلق الشرايين في الضمانات شرين. في سلالات الفئران الأخرى، والتي هي أكثر عرضة للنقص التروية بسبب غياب ضمانات الشرايين (على سبيل المثال BALB / ج)، ويلاحظ arterialization الشعرية 10. تم الكشف عن arterialization الشعرية بأقطار زيادة وتنمية العضلات على نحو سلس α تفاعل أكتين. الثاني، التحفيز الكهربائي للعضلات الوظيفية يؤدي إلى توسع الأوعية في الشرايين الطرفية للspinotrapeziلنا (الشكل 3B).
Protocol
Representative Results
Discussion
وربط spinotrapezius الفئران النموذج المقدم هنا هو نموذج فعال الحيوان الصغير الذي لدراسة التعديلات الوظيفية والهيكلية التي تنجم عن انسداد الشرايين. هذا النموذج هو مكملا للنموذج استخداما نقص التروية hindlimb 4، من حيث أنه يقدم وجهة نظر كامل العضلات شبكات الاوعية الدموية الدقيقة سليمة لقرار مكانية عالية. وعلاوة على ذلك، لأنه يقع هذا العضلات فقط تحت الجلد الظهرية، فإنه يمكن الوصول إلى التصوير المجهري مع المسلسل intravital، وتقديم الأدوية المحلية عن طريق زرع رقيقة أو superfusion الفيلم 2. هذه الميزات تجعل من جاذبية النموذج الحيواني الصغيرة التي لدراسة آثار من الأهداف العلاجية الرواية على إعادة عرض الأوعية الدموية وتوسع الأوعية الوظيفية التالية انسداد الشرايين.
ملاحظة يجب أن تستخدم بحذر عند مقارنة البيانات التي حصل عليها في نموذج ربط البيانات لspinotrapezius المكتسبة في نموذج ربط hindlimb بسبب د رئيسية عديدةifferences. أولا، يتم تثبيت العضلات spinotrapezius العضلات، وأنها تختلف عن عضلات الساق من حيث الوظيفة ونوع الألياف التوزيع. وقد أثبتت مجموعتنا سبق أن ربط تصلب في العضلات spinotrapezius يخلق نقص الأكسجة أو أقل لا يذكر في سلالات متطورة مع شبكات الضمان شريني، بالمقارنة مع نقص الأكسجة التي لوحظت في hindpaw بعد ربط الشريان الفخذي في النموذج hindlimb 1،8 – 10. لقد أظهرنا أيضا أن النموذج ربط spinotrapezius تنتج استجابة إعادة عرض مختلفة في BALB / ج الفئران مقارنة C57BL / الفئران 6، مع BALB / ج الفئران عن طريق إعادة عرض شبكات الضمانات الاحتياطية وإعادة عرض الشعرية C57BL / 6 عن طريق توسيع الاتصالات شريني القائمة 3. هناك اهتمام مواز بين هذه الملاحظات وتلك المصنوعة في نماذج ربط hindlimb، حيث BALB / ج الفئران تعاني من الانتعاش لفترة طويلة بعد ربط نضح مقارنة C57BL / 6 الفئران 9،11،12 </ سوب>. في نماذج أخرى من نقص تروية الأنسجة، العمر 13 الجنس الماوس (14) وجود المرض يؤثر أيضا 15 الردود الأنسجة 'إلى انسداد شريني، على الرغم من أننا لم تختبر بعد هذه تنبؤ في نموذج ربط spinotrapezius.
الثانية، وحجم الشريان الذي ligated في النموذج spinotrapezius أصغر بكثير من شريان الفخذ، وبالتالي فإن ربط يؤثر على حجم أصغر الأنسجة التي هي مزيد من المصب، أي على مستوى أدنى من شجرة الدورة الدموية، في spinotrapezius مقارنة hindlimb 3. وبالتالي، ينبغي النظر في الفرق التشريحية في موقع ربط في هذين النموذجين عند مقارنة ردود الفسيولوجية منها (على سبيل المثال إعادة عرض الأوعية الدموية) لهذا التدخل.
الثالث، قد النحافه من spinotrapezius تسمح الأكسجين للوصول إلى جزء من النسيج unperfused من الدول المجاورةالأنسجة، مقارنة مع نقص التروية ونقص الأكسجة مجتمعة في النموذج hindlimb كما ذكر أعلاه 3. الرابعة، واستعادة التدفق إلى جزء من المصب spinotrapezius من ربط أسرع مما كانت عليه في ربط hindlimb. نموذج ربط spinotrapezius هو نموذج فريد المزمن وينبغي عدم الخلط مع نماذج أخرى من انسداد الشرايين عابرة أو نماذج من الاصابة ضخه نقص التروية. نرى أنه من الممكن تكييف هذا النموذج لاستيعاب هذه الأنواع من الظروف، ولكن هذا خارج نطاق العمل الواردة في هذه الوثيقة. وأخيرا، فإننا نحذر من له صلة مباشرة ما قبل السريرية الملاحظات في هذا النموذج إلى المظاهر السريرية للمرض نقص تروية في البشر، وخصوصا عندما تستخدم الشباب والأصحاء والفئران بسبب الحدود الفسيولوجية الكامنة مثل ارتفاع معدل القلب 5. ومع ذلك، فإننا نعتبر هذا النموذج الجديد باعتباره أداة قيمة لكشف الآليات الأساسية للاستجابات لربط الأنسجة وتحديد الإمكاناتrapeutic الأهداف في جو المجراة في.
بالإضافة إلى الملاحظات المقدمة الجراحية في إجراء عملية ربط الشريان تغذية spinotrapezius (ملاحظة التشريحية (6A)، التمييز بين الشريان من الوريد (9A)، واستخدام رباط واحد (11A))، وبعض الجوانب الأخرى من الاستفادة من الإجراء المناقشة.
أولا، يتم إجراء شق مثالي الأولية التي عبر الحدود منصة الدهون الظهرية (أو مم عدة الذيلية إلى الكتف، إذا التصور عبر الجلد من غير الممكن) صغيرة مثل الجراح هو مريح مع، وتوسعت خلال الإجراء إذا لزم الأمر. هذه الممارسة يقلل من خياطة اللازمة لإغلاق الشق، وهو مناسب للجراح، ويقلل من الوقت الداخلي، وأيضا أقل تهيجا للحيوان خلال الانتعاش. بدلا من ذلك، قد شق الجلد أكبر من المناسب وفقا لتفضيل الجراح، منذ العضلات يمكن أن يكون أسهل لتحديد موقع مع حقل الموسعة. في هذه الحالة، قد شقالاستفادة من شكل حصان الأحذية المفتوحة مع وجه الإنسي للسماح للطي نحو العمود الفقري. في حين جعل شق الجلد وتمتد من خلال طبقات الجلد الثانوية، في حالة تلف سطح سفينة ويسبب نزيف، وتطبيق الضغط الخفيف مع شاش معقم وتوفير الوقت لالإرقاء.
أيضا من ملاحظة، فمن المهم للتعامل مع الأنسجة مع الحد الأدنى من القوة المطلوبة، وحيثما كان ذلك ممكنا الاستمرار مع ملقط أقرب إلى الحدود العضلات الجانبية للوبعيدا عن المنطقة الدماغية المقصود. هذه الممارسة تساعد على تجنب الإصابة سحق، الذي يمكن أن يؤدي إلى التهاب الأنسجة ردود إضافية بوساطة التي قد تؤدي إلى تشويش استجابة الأوعية الدموية إعادة عرض أثار من قبل ربط الشرايين.
في الختام، لقد أثبتنا استخدام العضلات spinotrapezius الفئران كنموذج لدراسة الأوعية الدموية الجراحية والأنسجة الردود على ربط شريني. هذا النموذج هو مناسبة لتقييم التغيرات intravital الأوعية الدموية (على سبيلسبيل المثال، توسع الأوعية الوظيفية)، وفيفو السابقين لتقييم التغيرات الوعائية (على سبيل المثال، والتصوير مناعي وتحديد الكميات من شبكات الأوعية الدموية). وقد أثبتت كل الدراسات ما قبل السريرية والسريرية أن استجابة الفرد لعرقلة شريني (على سبيل المثال عن طريق ربط في الفئران أو لويحات تصلب الشرايين لدى البشر) يعتمد على سنهم وجود أو عدم وجود مرض (مثل داء السكري) من قطر الشريان عرقلت ، التركيبة الجينية للفرد، والطلب التمثيل الغذائي في الأنسجة 11-15. نماذج الفئران، مثل تلك التي عرضت هنا، الباحث الاستفادة من الخلافات سلالة محددة التشريحية والوراثية والظواهر بأمراض محددة، مما يسهل تحقيق في هذه العلاقات المعقدة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كيفن ماكلويد أن نعترف لاستخدام موسيقاه الإبداعية العموم المرخصة في الفيديو المرتبطة بها، بما في ذلك (بترتيب ظهورها) له المسارات "استراحة المطار" "جدران"، و "ميلودراما المساء." نود أيضا أن نعترف Ndubisi Okeke وTorstrick فريدريك لمساعدتهم مع الفيديو الجراحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iris scissors | FST | 14090-09 | Type: Tool |
| Size 7 forceps | FST | 11271-30 | Type: Tool |
| Size 5 forceps | FST | 11251-20 | Type: Tool |
| Spring scissors | Roboz | RS5671 | Type: Tool |
| Microprobe | FST | 10140-03 | Type: Tool May be substituted with straight probe |
| Needle holder | FST | 12500-12 | Type: Tool |
| Induction chamber | JD Medical Dist. Co., Inc. | IC-1086 | Type: Equipment |
| Eye Gel | Dechra | NDC 17033-211-38 | Type: Reagent |
| Heat pad | FST | 21060-01 | Type: Equipment |
| Rectal temperature probe | FST | 21060-01 | Type: Equipment |
| Stimulating electrodes | FHC | UEWSGCSE0N1M | Type: Equipment |
| Artisan’s Polymer Clay | Polyform | N/A | Type: Equipment |
| PowerLab data acquisition system | ADInstruments | ML 845 | Type: Equipment |
| Stimulus isolator | ADInstruments | FE 180 | Type: Equipment |
| LabChart | ADInstruments | ML S060/7 | Type: Software |
| Reflected-light fluorescent microscope | Olympus | BFXM | Type: Equipment |
| High MW fluorescent dextran | Sigma | FD250S-100MG | Type: Reagent |
| Video calipers | Colorado Video | 308 | Type: Equipment |
| Automated Vascular Analysis (AVA) | Microvision Medical | Type: Software | |
| Anti-αSMA Conjugated Fluorophore | Sigma | 1A4-Cy3 | Type: Reagent Clonal, 1:100 |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BFXM | Type: Equipment |
| High-molecular weight fluorescent dextran | Sigma | FD250S-100MG | Type: Reagent |
References
- Bailey, A. M., O’Neill, T. J., Morris, C. E., Peirce, S. M. Arteriolar Remodeling Following Ischemic Injury Extends from Capillary to Large Arteriole in the Microcirculation. Microcirculation. 15, 389-404 (2010).
- Bruce, A. C., Peirce, S. M. Exogenous Thrombin Delivery Promotes Collateral Capillary Arterialization and Tissue Reperfusion in the Murine Spinotrapezius Muscle Ischemia Model. Microcirculation. 19, 143-154 (2012).
- Mac Gabhann, F., Peirce, S. M. Collateral capillary arterialization following arteriolar ligation in murine skeletal muscle. Microcirculation. 17, 333-347 (2010).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (23), e1035 (2009).
- Madeddu, P., et al. Murine models of myocardial and limb ischemia: diagnostic end-points and relevance to clinical problems. Vascul. Pharmacol. 45, 281-301 (2006).
- Cardinal, T. R., Kurjiaka, D. T., Hoying, J. B. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front. Physio. 2, 91 (2011).
- Sefcik, L. S., et al. Selective Activation of Sphingosine 1-Phosphate Receptors 1 and 3 Promotes Local Microvascular Network Growth. Tissue Eng. Part A. 17, 617-629 (2011).
- Deindl, E., et al. Role of Ischemia and of Hypoxia-Inducible Genes in Arteriogenesis After Femoral Artery Occlusion in the Rabbit. Circulation Research. 89, 779-786 (2001).
- Chalothorn, D., Zhang, H., Smith, J. E., Edwards, J. C., Faber, J. E. Chloride Intracellular Channel-4 Is a Determinant of Native Collateral Formation in Skeletal Muscle and Brain. Circulation Research. 105, 89-98 (2009).
- Scholz, D., et al. Contribution of Arteriogenesis and Angiogenesis to Postocclusive Hindlimb Perfusion in Mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 775-787 (2002).
- McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
- Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 1748-1756 (2011).
- Peng, X., et al. Gender differences affect blood flow recovery in a mouse model of hindlimb ischemia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, 2027-2034 (2011).
- Li, Y., Guan, H., Hazarika, S., Liu, C., Annex, B. H. Impaired angiogenesis following hind-limb ischemia in diabetes mellitus mice. Chin. Med. Sci. J. 22, 232-237 (2007).
