Optogenetic激活斑马鱼的体感神经元使用厨师tdTomato的

促进或抑制神经细胞的兴奋与定义的波长的光的optogenetic方法的发展使我们能够研究不同人群的神经元的神经回路，控制行为^{，1，19，21}的功能。这种技术通常被用于激活的神经元组，但它也可以被用来激活单个神经元的。斑马鱼幼虫，这些方法特别适合的，因为他们是半透明的，他们的神经系统迅速发展，并建立转基因动物是快速和常规。然而，重大的技术障碍必须克服，可靠地实现单神经元激活。

要优化程序optogenetic激活的单斑马鱼神经元，我们专注于躯体感觉神经元。斑马鱼幼虫检测各种体感刺激，使用两个群体神经元三叉神经元，支配头，及Rohon胡子（RB）的神经元，它支配身体的其他部位。每三叉和RB神经元投射的周轴突分支广泛在皮肤上，以检测的刺激和连接到下游的神经回路的中心轴突。动物早在21小时后受精（HPF）的响应触摸，表明已形成了相干的体感电路^5星，18。幼体发育过程中至少有三叉神经和RB神经元突触上的Mauthner细胞激活经典的逃生反应，但越来越多的证据表明，有多种类型的体感神经元与不同的连接模式，可能引起变化的逃逸行为^{，4， 10，12，14，15，16，17。}我们开发这种方法的动机是行为功能的不同类别的躯体感觉神经元的特征，但这种方法原则上可以用于研究的功能，几乎所有的神经元或神经元的LAR人口值斑马鱼。

道格拉斯等人以前描述了一种方法用于激活Channelrhodopsin-2表达的蓝色光的躯体感觉神经元，引出逃逸行为^3。他们使用的方法ISL1基因的增强子元件驱动CHR 2-EYFP躯体感觉神经元中的表达。这种转基因，然而，据报道，以显示相对微弱的荧光，需要共同注射的第二记者，UAS :: GFP，允许细胞表达CHR 2-EYFP的可视化。这种方法被用来引出24-48斑马鱼的行为反应之间，但可能不会得到响应过去的72 HPF。因此，虽然此方法适用于研究神经回路在非常早期的幼体阶段（24-48 HPF），它是不足为特征的神经回路和行为反应幼虫，中老年时更是明显不同的行为反应和神经回路是比较成熟的。

我们试图该技术在提高灵敏度的特点幼虫RB神经元亚群的功能。为了提高表达，我们使用了一个特定的体感增强剂^{（CREST3）20}驱动表达的LexA-VP16和LexA操纵的序列^{（4xLexAop）11}拉伸，扩增的荧光标记的光激活的信道的表达。此配置扩增表达的通道，省去了用于共表达的第二记者和允许我们直接确定每个神经元中的信道的相对丰度。使用的LexA蛋白/ LexAop序列有额外的优点，允许我们引入转基因成斑马鱼记者使用GAL4/UAS系统的线。转基因瞬时表达，这造成了不同程度的表达，但通常是足够强大的可视化的单个神经元的胞体和轴突预测数天。为了优化灵敏度性点燃，我们使用的光激活通道厨师，channelrhodopsin的变体组成的一个嵌合体：channelopsin-1（Chop1）和channelopsin-2（Chop2），交叉点在螺旋环EF ^13。此信道被激活为CHR 2在相同的波长，但需要较低的光强度进行激活，使得它比其他常用的途径，包括CHR 2更敏感。的厨师融合蛋白红色荧光蛋白，tdTomato，使我们能够筛选蛋白的表达没有激活的通道。作为光源，我们使用了一个二极管泵浦固态（DPSS）激光耦合到一个光纤电缆提供一个精确的，高功率的蓝色光脉冲到一个特定区域的幼虫。这使我们能够专注激光的单个神经元，省去了寻找罕见的转基因动物，在一个单一的神经元表达的通道。使用这种方法，我们能够激活单RB神经元，记录行为反应s的一个高速视频摄像机，和图像的激活的神经元，在高分辨率的激光共聚焦显微镜。