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Biology

Auswertung der Atemwege Mechanik in Mäuse mit den Forced Oscillation Technique

Published: May 15, 2013
doi:
10.3791/50172
, , , ,
1Meakins-Christie Laboratories, Department of Medicine,McGill University, 2SCIREQ Scientific Respiratory Equipment Inc.

Summary

Das vorliegende Protokoll bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Verfahren erforderlich, um Messungen der Atmungsorgane Mechanik sowie die Beurteilung der Atemwege Reaktionsfähigkeit auf inhalierte Methacholin bei Mäusen mit der erzwungenen Schwingung Technik (flexiVent auszuführen; SCIREQ Inc, Montreal, QC , Kanada).

Abstract

Die erzwungene Schwingung Technik (FOT) ist eine leistungsstarke, integrative und translationale Werkzeug erlaubt die experimentelle Bestimmung der Lungenfunktion bei Mäusen in eine umfassende, detaillierte, präzise und reproduzierbar. Es bietet Messungen der Atemwege Mechanik durch die Analyse von Druck und Volumen-Signale in Reaktion auf vordefinierte kleine Amplitude schwingenden Luftstrom Wellenformen, die in der Regel auf das dem Atemweg Öffnung aufgebracht erworben. Das vorliegende Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte, um adäquat ausführen erzwungenen Schwingung Messungen an Mäusen mit einem Computer-gesteuerten Kolben Ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, QC, Canada). Vorbereitende Schritte, mechanische Belüftung, Lungenfunktion Messungen und Datenanalyse: Die Beschreibung ist in vier Teile gegliedert. Es enthält auch Details, wie Atemwege Reaktionsfähigkeit auf inhalierte Methacholin beurteilen bei narkotisierten Mäusen, eine gemeinsame Anwendung dieser technique die sich auch auf andere Ergebnisse und verschiedene Erkrankungen der Lunge. Messungen in naiven Mäusen sowie aus einem oxidativen Stress-Driven-Modell der Atemwege Schäden erhalten werden dargestellt, um darzustellen, wie dieses Tool zu einem besseren Charakterisierung und das Verständnis der untersuchten physiologischen Veränderungen oder Krankheit-Modelle sowie für Anwendungen in neuen Forschungsbereichen.

Introduction

Angemessene Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften der Lunge bei Kleintieren geworden seit der aufkeimenden von Mausmodellen der Atemwege Wissenschaft unerlässlich. Wenn unter Verwendung der erzwungenen Schwingung Technik (FOT), eine Technik, auch beim Menschen verwendet werden, liefern diese Messungen eine starke, integrative und translationalen Ansatz, um sinnvolle physiologische Veränderungen zu studieren. FOT Messungen werden typischerweise durch Analysieren Druck und Volumen-Signale in Reaktion auf einen vorgegebenen, kleinen Amplitude, oszillierende Luftstrom Wellenform (auch als Störung oder Eingangssignal bezeichnet) auf das dem Atemweg Öffnung 1 aufgebracht erworbenen erhalten. In seiner einfachsten Form wäre ein FOT Störung eine einzelne sinusförmige Wellenform mit einer wohldefinierten Frequenz sein. Komplexere Störungen bestehen typischerweise aus einer Überlagerung einer Auswahl von spezifischen (gegenseitig prime) Frequenz Wellenformen, die ein breites Spektrum. Die Zersetzung des Multi-FrequenzEingangs-und Ausgangssignale in ihre Bestandteile unter Verwendung der Fourier-Transformation ermöglicht die Berechnung der Atmungsorgane Eingangsimpedanz (Zrs), dh die Übertragungsfunktion zwischen dem Eingangs-und Ausgangssignale, bei jeder Frequenz in der Störung 2 enthalten. Daher erlaubt die gleichzeitige FOT Beurteilung atemmechanischen über einen Bereich von Frequenzen in einem Handgriff 2. Fitting erweiterte mathematische Modelle (z. B. konstante Phase Ausführung 3), um die Impedanz Daten erlauben dann eine Aufteilung der Antwort in Atemwege (zentrale und periphere) und parenchymatösen Lungengewebe Parametern 1, 3. Da viele Faktoren, die die physiologische Reaktion (zB Atemfrequenz, Atemvolumen, Lungenvolumen, oberen Atemwege, Spontanatmung Bemühungen, den Zeitpunkt der Messungen) kontrolliert und standardisiert durch das Messsystem und experimentellen Verfahren, 1 die Technik KappeLage erzeugen präzise und reproduzierbare Messungen, sofern sie richtig durchgeführt wird. Das Ziel dieses Artikels ist es, einen detaillierten, chronologischen Beschreibung des Verfahrens, um solche Messungen in Mäusen ausführen benötigt wird. Das Protokoll besteht aus vier Teilen: vorbereitende Schritte (Reagenzien, Geräte und Themen), mechanische Belüftung, Lungenfunktion Messungen und Datenanalyse. Beispiele für repräsentative Ergebnisse der Atmungsorgane Mechanik unter Verwendung eines Computer-gesteuerten Kolben Ventilator (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, QC, Kanada) vorgesehen sind. Diese wurden aus naiven Mäusen als auch von einer oxidativen Stress-driven Modell Atemwege Schäden durch Entzündung der Atemwege, Epithelzellschädigung und erhöhte Atemwegsempfindlichkeit auf inhalierte Aerosol methacholine 4, dadurch erhalten. Während dieses Protokoll wird häufig verwendet, um Atemwege Reaktionsfähigkeit auf inhalierte Methacholin beurteilen, reicht es zu anderen Ergebnissen und verss Krankheiten wie Asthma, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), Emphysem, Lungenfibrose, Lungenversagen sowie transgene Mäuse von Pathologien ähnlich der menschlichen Krankheit. Forschungsergebnisse mit diesem Tool kann zu einer besseren Charakterisierung und das Verständnis der physiologischen Veränderungen oder Krankheiten Modellen sowie die Expansion in neue Forschungsbereiche beitragen.

Protocol

Die nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden von der McGill University Institutional Animal Care Committee in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care (CCAC) zugelassen. 1. Vorbereitende Schritte Lösungen: Methacholine: Bereiten Sie eine Stammlösung bei 50 mg / ml und machen serielle Verdünnungen (1:1) auf den zu testenden Konzentrationen 5 basieren. Lassen Sie die Lösungen auf Raumtemperatur, bevor Vernebeln 5 zu erreichen. Anästhetika: Verschiedene Therapien haben in der Literatur in verschiedenen Stämmen von Mäusen (Tabelle 1) berichtet. Hinweis: Regimen 1 wurde unter der vorliegenden Protokoll verwendet. Ausstattung: Das vorliegende Protokoll gilt für eine der beiden flexiVent Generationen flexiWare 7-Software unterstützt. Study Definition & Planning, Experimentieren Sessio: Die Software-Funktionen sind in drei Module gegliedertn und Bewertung und Reporting. Schalten Sie das System (flexiVent FX) und / oder die Software starten. An der ersten Sitzung Experimentieren oder jederzeit, bevor sie, öffnen Sie die Study Definition & Planning-Modul, um die Studie Struktur vorgeben. Klicken Sie auf das Erstellen einer neuen Studie Button und folgen Sie dem Assistenten, um eine Studie zu erstellen, skizzieren das Protokoll und definieren die experimentellen Gruppen und Themen untersucht werden. Einleiten Experimentieren Sitzung durch Öffnen des Experimentieren Session-Modul und nach dem Start-up-Sequenz für das Studium und Template-Auswahl. Vergeben Sie einen Betreff für die Messung vor Ort und bestätigen ihr Gewicht. Fahren Sie mit der Kalibrierung des Systems, indem Sie die Schritte in der Betriebssoftware beschrieben. Sie werden an einer Stelle dazu aufgefordert werden, um die Kanüle verwendet werden (Schritt 1.3.3) an den Y-Schlauch befestigen für die Kalibrierung. Critical Schritt. REPEAt Schritt 1.2.6 wenn die Kalibrierung erhaltenen Werte außerhalb des zulässigen Bereichs liegen. (Siehe flexiVent FX oder flexiWare 7 Benutzerhandbuch für die Modul-spezifische akzeptable Bereiche der Kalibrierwerte). Abbrechen Anweisungen, um Lüftung und Datenaufzeichnung beginnen, es sei denn bereit, das Experiment zu starten. Diese können zu einem späteren Zeitpunkt gestartet werden. Themen: Anesthetize das Thema mit geeigneten Dosen von Anästhetika (Tabelle 1). Stellen Sie sicher, dass das Thema hat eine chirurgische Ebene der Narkose erreicht. Das Motiv sollte keine Reaktion auf eine Zehe Prise zeigen und seine Atmung sollte regelmäßig sein und nicht gearbeitet. Führen Sie eine Tracheotomie und kanülieren die Luftröhre. Legen Sie das Tier auf den Rücken und stellen eine Quelle von Wärme (zB Temperatur gesteuerte Heizdecke oder eine Lampe mit einer 60 Watt-Glühbirne liegt etwa 45 cm von der Maus, um eine übermäßige Erwärmung zu vermeiden). Saubere the Rachenraum mit Alkohol und setzen die Luftröhre, indem Sie einen Hautschnitt und sanft Trennung der Submaxillardrüse und den Muskel Schicht abgedeckt wird. Heben Sie die Luftröhre mit einem Paar von Mikro-Pinzette und übergeben Naht darunter. Schneiden zwischen zwei Ringen des Knorpels nächsten Kehlkopf einen kleinen Einschnitt in die Luftröhre ohne Schnitte zu machen. Legen Sie die zuvor kalibrierten Kanüle in der Schnittführung und vorantreiben es vorsichtig in die Luftröhre die Länge von ca. 5 Ringe. Hinweis: Die vorliegenden Experimente wurden unter Verwendung einer 1,2 cm langen Metall 18 Gauge Kanüle. Critical Schritt. Sichern Sie die Kanüle in Ort mit der Naht. Die Befestigung sollte eine luftdichte Dichtung um die Kanüle. 2. Mechanische Lüftung Bringen Sie das Tier in der Nähe des Ventilators. Starten Beatmung durch Auswählen einer vordefiniertenoder eine angepasste Belüftung Profil in der Lüftungs-Docker. Schließen Sie das Tier an das Beatmungsgerät über den Y-Schlauch. Kritischer Schritt. Richten des Tieres an das Beatmungsgerät und sicherzustellen, dass die Trachealkanüle in der gleichen Ebene wie der Ventilator auf eine mögliche Okklusion oder tracheale Kanüle Verdrehung zu vermeiden. Kritischer Schritt. Führen Sie einen tiefen Inflation Störung durch einen Doppelklick auf den Namen, um die Störung Kanüleneinführvorrichtung und Befestigung überprüfen. In Abwesenheit eines Lecks, sollte das System in der Lage sein, um einen Druck von 30 cm H 2 O über 3 Sekunden lang halten, ohne übermäßige Lautstärke Verschiebung (Abbildung 1). Das aufgenommene Volumen und Druck Spuren sollte auch ohne Anzeichen von Offset-oder Verformung glatt wie diese eine Kanüle Obstruktion oder Abhandenkommen geben könnten. Wenn nötig, verbinden Vitalzeichen Wandler für Herzfrequenz und Körpertemperatur Überwachung. Datenaufzeichnung kann eingeleitet werden either manuell oder automatisch über ein Skript. 3. Lungenfunktionsmessungen Messungen oder Befehle (zB Vernebler Aktivierung, Event Marker) kann automatisiert über vordefinierte oder benutzerdefinierte Skripts für die höchst kontrollierten und wiederholbaren experimentellen Prozess (Abbildung 2). Sechs Familien von Störungen, die zu einer Reihe von Parametern können die Atemwege Thema Mechanik an der Grundlinie zu beschreiben und nach einer bestimmten Herausforderung (Tabelle 2). Critical Schritt. Wenn Sie bereit sind, um mit den Messungen beginnen, führen Sie eine tiefe Inflation zu geschlossenen Bereichen Lunge rekrutieren und zu standardisieren Lungenvolumen Geschichte. Critical Schritt. Überprüfen Sie die Abwesenheit von spontanen Atemanstrengungen, indem Sie einen Test Messung (z. B. PV-P oder PVs-V). Beachten Sie die Druck-Signal Messkurven im ausgewählten Datensatz Aussicht. Mit schrittweise PV Kurven,Druckplateaus sollte auch ohne Ausschläge nach unten definiert werden. Ein Schwung nach unten in Druck geben würde eine Einatembemühung vom Tier (Abbildung 3). Leiten Sie die ausgewählte Skript durch Doppelklick auf den Titel. Scripts in der vorliegenden Studie verwendet in der Regel für Messungen im Lieferumfang enthalten: Eine Folge von Baseline-Messungen in dreifacher Ausfertigung. Aktivierung der Vernebler für die Beurteilung der Atemwege Reaktionsfähigkeit auf inhalierte Methacholin. Hinweis: Wenn Sie vom System aufgefordert werden, laden rund 100 ul Kochsalzlösung oder einer Lösung von Methacholin in den Zerstäuber. Nebulization startet und stoppt automatisch. Eine Sequenz von eng beabstandeten Messungen (alle 10-15 sec) über einen Zeitraum von etwa 3 min nach der Aktivierung des Zerstäubers. Eine Aufforderung zur Durchführung einer weiteren Herausforderung und wiederholen Sie eine Sequenz von Messungen. Hinweis: Trocknen der Innenseite der Vernebler-Halterung mit einem Tupfer in bwischen Herausforderungen helfen können verhindern und Kondensation von Gebäude-up in der Inspirationsleitung. Am Ende des Experiments, stoppen Belüftung und lösen das Thema. Wechseln Sie in das nächste Thema in der Betriebssoftware und bestätigen ihr Gewicht. Critical Schritt. Spülen und trocknen Vernebler, Adapter, Y-Schlauch und Kanüle zwischen Subjekten. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.6 bis 3.6. Am Ende des Tages, in der Nähe der experimentellen Sitzung. Denken Sie daran, spülen und trocknen Vernebler, Adapter, Y-Schlauch und Kanüle und das System Exspirationsventils vor Verlassen des Labors, indem Sie die Anweisungen des Herstellers reinigen. 4. Data Analysis Die Software berechnet und zeigt Parameter mit einer Störung verbunden ist. Es bietet auch eine Determinationskoeffizient (COD), die den Sitz des mathematischen Modells mit den Daten widerspiegelt. Jeder Datensatz mit einer Isoizient COD markiert ist wie von der Software ausgeschlossen. Bewertung von experimentellen Sitzungen werden Daten Re-Analyse und Erstellung von Export-Szenarien in der Bewertung und Reporting-Modul der Software. Öffnen Sie die Bewertung und Reporting-Modul, und erstellen Sie eine Export-Szenario, wobei darauf zu achten nur die Datensätze mit einer ausreichenden COD. Export als benötigten Parameter, Druck-oder Fluss-Volumen-Kurve, Rohdatensatzes Signale oder Informationen unterliegen einer Tabellenkalkulation (siehe Tabelle 3). Durchschnittliche Baseline-Messungen für jeden Parameter und Plot alle Messungen als Funktion der Zeit (siehe Abbildung 4). Sie können dann wählen, um die Fläche unter der Kurve zu berechnen, analysieren das allgemeine Profil der Kurven oder führen Sie eine statistische Analyse. Um Atemwegsempfindlichkeit Ergebnisse in Abhängigkeit von der Konzentration des methacholine auszudrücken, für jeden Gegenstand zu bestimmen, Parameter und experimentelle Bedingung entweder ein bestimmterPunkt (zB peak) oder einer bestimmten Zeit nach jedem methacholine Herausforderung. Berechnen Gruppe Durchschnittswerte und Bericht oder Grundstück für jede experimentelle Bedingung (Tabelle 4, Abbildung 5). Sie können sich auch die Berechnung der Konzentration, die eine Verdoppelung eines bestimmten Parameters Ausgangswert (PC 200; 5C), Anlegen einer Normalisierung (zB% Baseline) oder eine statistische Analyse.

Representative Results

Atmungssystem Mechanik Messungen. Tabelle 4 zeigt typische Ergebnisse der naiven A / J-Mäuse an der Grundlinie und folgende Methacholin Bronchokonstriktion erhalten (12,5 mg / ml) mit einem der beiden flexiVent Generationen flexiWare 7-Software unterstützt. Mechanik der Atemwege, unter geschlossenen Bedingungen Brust dh wurden durch alternierende Störungen der Einzel-und Breitband-Frequenz erzwungene Schwingung Familien in einer Art und Weise eng beieinander (Schnappschuss-150, Quick-Prime-3, respectively) beurteilt. Seit Lüftung während der Messung, das Quick Prime-3, die einen ähnlichen Frequenzbereich abdeckt wie die Prime-8 angehalten wird, hat aber eine kürzere Dauer (3 vs 8 sec), wurde ausgewählt, um die Apnoe zu verkürzen, minimieren die Wirkung von die Störung auf Blutgase und bieten eine bessere Auflösung der Antwort. Parameter mit jeder Störung assoziiert wurden berechnet automatically durch die Betriebssoftware. Ergebnisse zeigen, dass die zwei Generationen der flexiVent System entspricht Messungen der Atemmechanik produziert. Site of Lunge Antwort. Unterscheiden Sie die Website von Lungen-Reaktion ermöglicht die Ermittler weiter zu lokalisieren betroffenen Regionen sowie um mögliche Punkte von 6 pharmakologische Intervention zu identifizieren. Zum Beispiel zeigen naiv A / J-Mäusen eine Erhöhung des Ausgangswertes Widerstand, wenn die endexspiratorischer Druck gegen die Messungen vorgenommen werden 3-9 cm H 2 O (6A, Schnappschuss-150) erhöht wird. In dem vorliegenden Beispiel wird, sofern die Verwendung von Breitband-FOT Messungen (Quick Prime-3) Informationen, die Basis für die Änderung des Widerstands verdeutlichen: Die Veränderung der endexpiratorischen Druck zu einer Abnahme in den Atemwegen Widerstand (R N), die mit der bronchodilatatorische Auswirkungen einer höheren Lungenvolumen und die größere Inflation drückenure (6D) und eine Zunahme der Dämpfung Gewebe (G, Fig. 6E), ein Parameter eng Widerstand des Gewebes, das Gewebe Viskoelastizität und möglicherweise den Widerstand der kleinen Atemwege 7 reflektiert verwandt. Letzteres ist bekannt, dass mit zunehmendem Lungenvolumen zu erhöhen. Atemwegshyperreaktivität. Nach Chlorgas Belichtung, Atemwege Reaktionsfähigkeit auf inhalierte Methacholin steigt auf Luftaussetzzeiten in Balb / c-Mäusen als Folge der Atemwege Schaden 4 (Abbildung 2). Chlor ist bekannt, oxidativen Stress zu induzieren, was zu einer Zerstörung der strukturellen Zellen in den Atemwegen, insbesondere Epithelzellen und Induzieren Rekrutierung von Entzündungszellen. Wie in 5 dargestellt, können Änderungen in den Parametern, die Atmungsorgane Mechanik in Reaktion auf die zunehmende methacholine Herausforderungen gesehen werden. Im Vergleich zu Luft ausgesetzten Mäuse, Mäuse chlori ausgesetztNe-Gas angezeigt größer Maximalreaktionen auf allen FOT Parameter (5A, 5B, 5D bis 5F) sowie eine statistisch signifikante Linksverschiebung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve, die durch eine Verringerung der Konzentration von Methacholin erforderlich, um eine Verdopplung des Widerstandes verursachen beispielhaft und Elastanz (PC 200; 5C). Diese Ergebnisse zeigen jeweils Atemwegshyperreaktivität und Überempfindlichkeit gegenüber inhalativen Methacholin nach Exposition gegenüber Chlorgas. Andere Messungen. Neben BAV kann die flexiVent System auch verwendet werden, um andere Arten von Lungenfunktion 8-10 oder Herz-Kreislauf-11-Messungen sammeln. Fig. 7 zeigt eine repräsentative stufenweise Druck-gesteuerte Druck-Volumen-Kurve in naiven A / J-Mäusen unter Baseline-Bedingungen . Der obere Abschnitt der Deflation Schenkel der Kurve der Salazar-Knowles Gleichung 12 zu passen </ sup> und Parameter werden automatisch von der Software berechnet. Tabelle 1. Beispiele für Anästhesie Regimen in Mäusen verwendet. Klicken Sie hier, um größere Tabelle anzuzeigen . Tabelle 2. Perturbations für Lungenfunktion Messungen in Mäusen verwendet. * Erweiterung erforderlich ist, um das System. Gegenstand muss auch in einem geschlossenen Plethysmographen Kammer während der Messung sein.Lank "> Klicken Sie hier, um größere Tabelle anzuzeigen. Tabelle 3. Beispiel der exportierten Parameter aus den Einzel-und Breitband-Frequenz erzwungene Schwingung Störung Familien. Klicke hier, um eine größere Tabelle anzuzeigen . Tabelle 4. Systemvergleich. Vergleich Lungenmechanik Parameter gesammelt mit den beiden Generationen der flexiVent System flexiWare 7-Software betrieben. Die Ergebnisse wurden in naiven A / J-Mäusen (n = 5 erzeugt / Gruppe) an der Grundlinie und folgende Methacholin Bronchokonstriktion (Mch 12,5 mg / ml). * Gruppen wurden mit Hilfe eines Zwei-Wege-ANOVA für wiederholte Messungen und das Protokoll 10 der individuellen Antworten auf Homogenität der Varianzen (GraphPad Prism, Version 5.03, GraphPad Software, San Diego, USA). Abbildung 1. Screenshot einer tiefen Lunge Inflation. Das obere Feld zeigt das Volumen durch den Kolben des Beatmungsgerätes (rote Kurve) und dem Volumen geliefert mit dem Thema (graue Kurve) verschoben wird. Das untere Feld zeigt den Zylinderdruck ansteigend auf einen eingestellten Druck von 30 cm H 2 O über einen Zeitraum von 3 Sekunden gehalten, zur gleichen Zeit konstant. 172/50172fig2.jpg "alt =" 2 "/> Abbildung 2. Beispiel einer typischen Skript verwendet die Atmungsorgane Mechanik an der Grundlinie zu beurteilen. Abbildung 3. Spontane Atemanstrengungen während der Ausführung einer schrittweisen Druck-Volumen-Kurve. Abbildung 4. Zeit-Verlauf Antwort folgende Erhöhung der inhalierten Methacholin Herausforderungen. Ergebnisse sind als Mittelwert (± Standardabweichung) von einer Gruppe von 5 naiv spontan hyperresponsive A / J-Mäusen ausgedrückt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen . <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Abbildung 5. Änderungen in Atmungsorgane Mechanik nach Erhöhung Methacholin Herausforderungen in Chlor-und Luft-exponierten Balb / c Mäusen. Höchstwert war für jeden Parameter in jedem Fach und experimentelle Bedingung identifiziert. Gruppe Durchschnittswerte wurden dann berechnet (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 4-6). Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch Analyse der Varianz mit der log 10 von individuellen Reaktionen auf Homogenität der Varianzen beurteilt. Die Konzentration methacholine Herstellung einer Verdoppelung des Ausgangswertes (PC 200) wurde durch den Einbau eines Polynoms zweiter Ordnung, um individuelle Dosis-Wirkungs-Kurven und Interpolation der angepassten Kurve erhalten. Datenpunkte werden in D fehlt, E und F in der Chlor-exponierten Mäusenbei den beiden höchsten Konzentrationen Methacholin durch nicht ausreichend hohen Bestimmtheitsmaßen was eine schlechte Passform des mathematischen Modells auf die Daten. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen . Abbildung 6. Partitionieren der Atemwege Antwort in Atemwege und Lungengewebe Mechanik. Experimental Spur von einem naiven A / J-Mäusen veranschaulicht einzigen (2,5 Hz) und Breitband (1-20.5Hz) Frequenz erzwungene Schwingung Messungen der Atemmechanik in dreifacher Ausfertigung an zwei verschiedenen endexspiratorischer Drücke (3 & 9 cm H 2 O). Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen </a>. Abbildung 7. Druck-Volumen-Kurve in naiven A / J-Mäusen unter Ausgangsbedingungen. Druck-Volumen-Kurven wurden mit einer schrittweisen Druck-driven Störung (PV-P), um sicherzustellen, dass jeder Mauslungen dem gleichen Druck aufgepumpt wurden, unabhängig von ihrem Zustand. Salazar-Knowles Gleichung Parameter von einzelnen Druck-Volumen-Kurven extrahiert wurden gemittelt und in einer Tabelle Format. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 6) angegeben.

Discussion

Die fortgesetzte Untersuchung der Atemwege Dysfunktion, wie es zu Asthma und anderen Erkrankungen der Lunge betrifft bleibt entscheidend für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen von Krankheiten und die Entwicklung von Behandlungsmöglichkeiten. Die Verwendung von Mäusen zu modellieren Atemwegserkrankung war wesentlich in die Förderung des Verständnisses in dieser Krankheitsmechanismen. Bei der Prüfung der Bewertung Atemwege Funktionsstörung bei einem Patienten so klein wie eine Maus, mit zuverlässigen und genauen Mittel, mit denen die Lungenfunktion zu messen, ist kritisch. Darüber hinaus mit Werkzeugen ist, die Einblicke auf den Standort der Atemwege Dysfunktion oder therapeutische Wirkung ist von unschätzbarem Wert. Das BAV Technik vereint all diese Attribute und bietet eine leistungsstarke, integrative und translationalen Ansatz zu physiologischen Veränderungen zu bewerten.

Um mit dieser Art der Messung bei Mäusen erfolgreich zu sein, ist besonders auf einige Schritte gegeben werden, nämlich die Kalibrierung des Systems, der Widerstand des endotrachealen cannula, die Art der Vernebler (ebenso wie das operative Einstellungen) die Positionierung des Tieres und die Standardisierung von Lungenvolumen Geschichte. Darüber hinaus ist es zwingend erforderlich, um gültige Datensätze zu erhalten, dass das Thema der Atmungsorgane passive während der Messungen bleibt. Dies kann durch die Verabreichung eines muskellähmende Mittel erreicht werden kann, arbeiten auf einer tiefen Ebene der Narkose oder durch Hyperventilieren das Thema zu einer Apnoe (siehe Tabelle 1) zu induzieren. Ermittler können durch die Beherrschung des Systems und seiner Betriebssystem-Software zu starten, falls gewünscht, mit Test-Lasten, während den Erwerb der notwendigen Fähigkeiten für Messungen in Mäusen. Es wäre dann logisch, reproduzierbare Ergebnisse in naiven Tieren, bevor er nach Modellen oder Krankheit behandelten Mäuse zu erzeugen. Da ein wichtiger Anteil der Krankheit Modelle Atemwege Forschung einbeziehen Aussetzen Tiere zu Agenten wie Allergene, Toxine, Schadstoffe, Zigarettenrauch oder Gase, die Variabilität in den Ergebnissen mit den measuremen erhaltent-Technik in diesem Artikel beschrieben, weshalb sie unter dem Belichtungsvorgang beeinflußt werden. Standardisierung der wichtigsten experimentellen Prozessen (zB mit Computer-gesteuerten Belichtung und Messsysteme 6, 13, 14) könnte möglicherweise erhebliche Auswirkungen bei der Verringerung der Variabilität.

Beispiele in diesem Artikel vorgestellt stellen eine Auswahl von typischen Ergebnisse von naiven und Chlor-exponierten Mäusen Experimente während die Stärken als auch die Grenzen der Technik. Wie beispielsweise in Fig. 6 zu sehen ist, ist die Technik in der Lage ist reproduzierbar Lungenfunktionsmessungen. Während ähnliche Baseline Widerstandswerte zwischen Maus-Stämme gemeldet wurden, wurden Unterschiede in Elastanz jedoch 15 beobachtet. Wesentliche Änderungen sind auch zwischen Säugling und erwachsenen Mäusen 16 erwartet werden. Wie bei anderen in vivo physiologische Einschätzung, hohe Präzision Ergebnisse, wie those durch das BAV erzeugt, mit einer Konzession über den natürlichen Zustand der Probanden kommen. Dieses Prinzip, das als Phänotypisierung Unschärferelation 1 bezeichnet wird, gilt für die vorliegenden Protokoll in dem Sinne, dass Messungen in narkotisiert werden, tracheotomierte (oder oral intubiert) und beatmeten Patienten benötigen. Eine weitere Einschränkung der Technik wird in 5D-5F, wo Daten liegen nicht bei den höchsten Konzentrationen für die Chlor-exponierten Gruppe zur Verfügung, weil die Passform des Constant-Phasen-Modell auf die Daten ist über moderaten Bronchokonstriktion Armen beobachtet werden. Allerdings könnte schwer bronchoconstricted Tiere durch die Analyse Zrs direkt 15 oder über Dritte post-Analyse-Software, um komplexere mathematische Modelle passen, z. B. unter Berücksichtigung der Heterogenität der mechanischen Funktion 17 beurteilt werden. Ausgeschlossene Datensätze können auch beobachtet werden, wenn das Tier die Atemwege nicht ausreichend p werdenassive oder wenn der Widerstand der Kanüle zu hoch ist. Als Faustregel gilt, dass der Widerstand der Kanüle nicht überschreiten des Tieres Widerstand an der Grundlinie. Arbeiten mit einer Kanüle mit größerem Innendurchmesser und / oder kürzere Länge wird dazu beitragen, die Kanüle aufweist. Schließlich kann die vorliegende Demonstration FOT Messungen in Mäusen als zeitaufwendig und daher weniger effiziente Methode oder weniger für Longitudinalstudien gegenüber weniger invasive Techniken wahrgenommen werden. Letztere sind jedoch mit viel Unsicherheit in Bezug auf der Grundlage ihrer Ergebnisse verbunden und werden von vielen als fehlerhaft angesehen 1. Wiederholte invasive Messungen sind in oral intubiert Tieren möglich, obwohl technisch anspruchsvollen 17.

Aus den Beispielen zeigten Ergebnisse der Gleichwertigkeit der beiden Generationen der flexiVent System zu produzieren Messungen der Atemmechanik sowie Atemwegs hyperreactivität und Überempfindlichkeit gegenüber inhalativen Methacholin nach Chlor-Exposition bei Mäusen. Wenn zur Charakterisierung oder verstehen physiologischen Veränderungen oder Krankheiten Modelle, die detaillierte Messung Aspekt im Zusammenhang mit der Technik kann dazu beitragen, den aktuellen Stand des Wissens zu erweitern.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

TKMcG wird durch ein Stipendium von der kanadischen Thoracic Society unterstützt.

AUTOREN BEITRAG

Alle Autoren haben an der Konzeption des Manuskripts. Darüber hinaus TKMcG das Projekt initiiert, gesammelt experimentellen Ergebnisse, trugen zu dem Schreiben des Manuskripts und seine kritische Überprüfung. AR gesammelt und experimentellen Ergebnisse analysiert, entwarf das Manuskript und trug zu ihrer kritischen Bewertung. LF gesammelt experimentellen Ergebnisse und dazu beigetragen, die kritische Durchsicht des Manuskripts. TFS und JGM dazu beigetragen, die kritische Durchsicht des Manuskripts.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
REAGENTS
Acetyl-β-methylcholine chloride Sigma-Aldrich A-2251 Methacholine
Micro-Adson forceps, serrated 12 cm Fine Science Tools 11018-12
Moria MC31 forceps, serrated-curved Fine Science Tools 11370-31
Iris scissors-tough cut, straight 11.5 cm Fine Science Tools 14058-11
Spring scissors-2.5 mm blades, straight Fine Science Tools 15000-08
Non-sterile blunt needle (18g x ½”) Brico Medical Supplies Inc. BN1805 Endotracheal cannula
Non-sterile 5-0 silk suture Seraflex IDI58000
Phosphate buffered solution Gibco 14190-144
15 ml conical tubes Starstedt SS-4001
1 ml TB syringes Becton Dickinson 309626
200 μl filter tips Biosphere 70.760.211
EQUIPMENT
flexiVent FX SCIREQ Inc. sales@scireq.com www.scireq.com
Aerogen Aeroneb nebulizer SCIREQ Inc. sales@scireq.com www.scireq.com
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References

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McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique. J. Vis. Exp. (75), e50172, doi:10.3791/50172 (2013).
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