Evaluatie van Respiratory System Mechanics in Muizen met behulp van de Gedwongen Oscillatie techniek
Summary
Het huidige protocol bevat een gedetailleerde stap-voor-stap beschrijving van de vereiste om metingen van de ademhalingswegen mechanica, alsmede de beoordeling van de luchtwegen voor geïnhaleerde methacholine in muizen met behulp van de geforceerde oscillatie techniek (flexiVent voeren procedures; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canada).
Abstract
De geforceerde oscillatie techniek (FOT) is een krachtige, integratieve en translationeel instrument toelaat de experimentele beoordeling van de longfunctie bij muizen in een uitgebreide, gedetailleerde, nauwkeurige en reproduceerbare wijze. Het biedt metingen van ademhalingswegen monteurs van de analyse van druk en volume signalen verworven in reactie op vooraf bepaalde, kleine amplitude, oscillerende luchtstroom golfvormen, die typisch worden toegepast bij luchtwegopening het onderwerp. Het huidige protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om adequaat te voeren gedwongen oscillatie metingen in muizen met behulp van een computer-gestuurde zuiger ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). De omschrijving is verdeeld in vier delen: voorbereidende stappen, mechanische ventilatie, longfunctie metingen, en de data-analyse. Het bevat ook informatie over hoe u luchtwegreactiviteit beoordelen geïnhaleerde methacholine in verdoofde muizen, een veel voorkomende toepassing van deze technique, die zich ook uitstrekt tot andere uitkomsten en diverse long pathologieën. Meetresultaten naïeve muizen en van een oxidatieve spanning gedreven model van luchtweg schade worden te illustreren hoe dit instrument kan bijdragen tot een beter begrip van de karakterisering en bestudeerde fysiologische veranderingen of ziektemodellen en voor toepassingen in nieuwe onderzoeksgebieden.
Introduction
Afdoende karakterisering van de mechanische eigenschappen van de longen in kleine dieren is sinds de ontluikende van muismodellen in respiratoire wetenschap essentieel geworden. Wanneer deze wordt uitgevoerd met behulp van de geforceerde oscillatie techniek (FOT), een techniek die ook wordt gebruikt bij menselijke proefpersonen, deze metingen geven een krachtige, integratieve en translationele benadering om zinvolle fysiologische veranderingen te bestuderen. FOT metingen worden meestal verkregen door analyse van druk en volume signalen verworven in reactie op een vooraf bepaalde, kleine amplitude, oscillerende luchtstroom golfvorm (ook wel storing of ingangssignaal) toegepast op het onderwerp luchtwegopening 1. In zijn eenvoudigste vorm, zou een FOT verstoring een sinusvormige golfvorm op een welbepaalde frequentie. Meer complexe verstoringen bestaan meestal uit een superpositie van een selectie van specifieke (onderling prime) frequentie golfvormen die een breed spectrum. De ontleding van de multifrequentieen uitgangssignalen in hun bestanddelen, met gebruik van de Fourier transformatie kan de berekening van de ademhalingsorganen ingangsimpedantie (Zrs), dwz de overdrachtsfunctie tussen de ingangs-en uitgangssignalen, bij elke frequentie in de verstoring 2. Daarom FOT maakt de gelijktijdige beoordeling van ademhalingsmechanica over een bereik van frequenties in een manoeuvre 2. Fitting geavanceerde wiskundige modellen (bv. het Constant Fase Model 3) om de impedantie gegevens mogelijk dan een opdeling van de reactie in de luchtwegen (centrale en perifere) en parenchymaal longweefsel afhankelijke parameters 1, 3. Omdat veel factoren die de fysiologische respons (bijv. ademhaling frequentie, ademvolume, longvolume, bovenste luchtwegen, spontane ademhaling inspanningen, de timing van de metingen) worden gecontroleerd en geijkt door het meetsysteem en experimentele procedures, 1 is de techniek dopstaat van het genereren van nauwkeurige en reproduceerbare metingen op voorwaarde dat het correct wordt uitgevoerd. Het doel van dit artikel is een gedetailleerd, chronologische beschrijving van de procedure nodig om dergelijke metingen uit te voeren bij muizen verschaffen. Het protocol bestaat uit vier delen: voorbereidende stappen (reagentia, apparatuur en onderwerpen), mechanische ventilatie, longfunctie metingen, en de data-analyse. Voorbeelden van representatieve resultaten van de ademhalingswegen monteurs gegenereerd met behulp van een computergestuurde zuiger ventilator (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada) zijn aanwezig. Deze werden verkregen van naïeve muizen als van een oxidatieve spanning gedreven model van de luchtwegen schade gekenmerkt door luchtwegontsteking, epitheelcel-beschadiging en hogere luchtwegen voor geïnhaleerde aerosol methacholine 4. Hoewel dit protocol wordt vaak gebruikt om de luchtwegen voor geïnhaleerde methacholine beoordelen, het strekt zich uit tot andere uitkomsten en various ziekten waaronder astma, chronische obstructieve longziekte (COPD), emfyseem, longfibrose, longbeschadiging alsmede transgene muismodellen van ziekten die lijkt op humane ziekte. Onderzoeksresultaten met behulp van deze tool kan bijdragen aan een beter karakterisering en begrip van fysiologische veranderingen of ziekte modellen evenals aan expansie in nieuwe onderzoeksgebieden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De voortdurende studie van de luchtwegen disfunctie in relatie tot astma en andere longaandoeningen blijft cruciaal belang voor het begrijpen van de onderliggende mechanismen van ziekten en de ontwikkeling van behandelingen. Het gebruik van muizen om model luchtwegaandoeningen is van essentieel belang bij het verkrijgen van inzicht in deze ziektemechanismen geweest. Bij het overwegen evaluatie luchtwegen disfunctie bij een patiënt zo klein als een muis, met betrouwbare en nauwkeurige middelen waarmee aan longfunctie meten is essentieel. Overigens vormt gereedschap staat om inzichten over de locatie van de luchtwegen disfunctie of therapeutisch effect onschatbaar. De FOT techniek combineert al deze eigenschappen en biedt een krachtige, integratieve en translationele benadering van fysiologische veranderingen te evalueren.
Om te slagen met dit soort meting in muizen, moet speciale aandacht worden besteed aan een paar stappen, namelijk de kalibratie van het systeem, de weerstand van de endotracheale cannula, het soort vernevelaar (evenals de werkstanden) het positioneren van het dier en de standaardisering van longvolume geschiedenis. Bovendien is het noodzakelijk om geldige datasets verkrijgen dat luchtwegen van de patiënt passief blijft tijdens de meting. Dit kan worden bereikt door de toediening van een spier verlammende middel, werkzaam bij een diepe vlak van anesthesie of door hyperventileren het onderworpen aan apneu (zie tabel 1) te induceren. Onderzoekers kunnen beginnen met het beheersen van het systeem en de besturingssoftware, indien gewenst, met testwaarden, terwijl het verwerven van de nodige vaardigheden voor metingen bij muizen. Het zou dan logisch zijn om reproduceerbare resultaten in naïeve dieren te genereren voordat hij naar de ziekte van modellen of behandelde muizen. Omdat een belangrijk deel van ziektemodellen in respiratoire betreft onderzoek bloot dieren middelen zoals allergenen, toxinen, verontreinigende, sigarettenrook of gassen, variabiliteit van de resultaten verkregen met de METINGt techniek beschreven in dit artikel kan derhalve worden beïnvloed door de procedure belichting gebruikt. Standaardisatie van de belangrijkste experimentele processen (bijv. met behulp van computergestuurde belichting en meetsystemen 6, 13, 14) zou kunnen hebben een aanzienlijke invloed op het verminderen van variabiliteit.
Voorbeelden in dit artikel zijn een selectie van typische resultaten van naïeve en chloor-blootgestelde muizen experimenten terwijl het benadrukken van de sterke punten, alsmede de beperkingen van de techniek. Zoals bijvoorbeeld in figuur 6, de techniek kan genereren reproduceerbare metingen van de longfunctie. Terwijl vergelijkbare baselineweerstand waarden gerapporteerd tussen muizenstammen, werden verschillen in elasticiteit echter waargenomen 15. Substantiële wijzigingen zijn ook te verwachten tussen kind en volwassen muizen 16. Zoals voor andere in vivo fysiologische beoordeling hoge precisie resultaten, zoals those gegenereerd door de FOT, komen met een concessie met betrekking tot de natuurlijke staat van de proefpersonen. Dit principe, dat wordt aangeduid als de fenotypering onzekerheidsprincipe 1, is van toepassing op het huidige protocol in de zin dat de metingen moeten worden gemaakt in verdoofde, tracheotomised (of oraal geïntubeerd) en mechanisch geventileerde onderwerpen. Een andere beperking van de techniek is waarneembaar in figuur 5D-5F waar gegevens zijn bij de hoogste concentraties van de chloor-blootgestelde groep niet beschikbaar omdat de pasvorm van de Constant fase model om de gegevens slecht is boven de gematigde niveaus van bronchoconstrictie. Echter aanzienlijk kunnen bronchoconstrictie dieren worden beoordeeld door het analyseren Zrs direct 15 of door derden na analyse software past meer complexe wiskundige modellen, bijvoorbeeld rekening houdend met de heterogeniteit van mechanische functie 17. Uitgesloten datasets kunnen ook worden waargenomen wanneer de luchtwegen van de dieren zijn niet voldoende passive of als de weerstand van de canule te hoog. Als vuistregel geldt, moet de weerstand van de canule niet bij aanvang hoger zijn dan de weerstand van het dier. Werken met een canule van grotere binnendiameter en / of kortere lengte zal helpen de canule weerstand. Tenslotte kan de onderhavige aangetoond FOT metingen in muizen worden gezien als een tijdrovende en dus minder efficiënte methode of minder voor longitudinale studies vergeleken met minder invasieve technieken. Maar de laatste worden geassocieerd met een grote mate van onzekerheid over de basis van hun resultaten en worden door velen gezien als zijnde gebrekkig 1. Herhaalde invasieve metingen zijn mogelijk in oraal geïntubeerd dieren, hoewel technisch meer uitdagende 17.
Uit de voorbeelden, resultaten toonden de equivalentie van de twee generaties van de flexiVent systeem produceert metingen van respiratoire mechanica, alsmede luchtwegen hyperreacteit en overgevoeligheid voor geïnhaleerde methacholine na chloor-blootstelling bij muizen. Bij gebruik te karakteriseren of te begrijpen fysiologische wijzigingen of ziektemodellen, de gedetailleerde meting verbonden aspecten van de techniek kan bijdragen tot de huidige kennis verlengen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TKMcG wordt ondersteund door een studentship van de Canadese Thoracic Society.
BIJDRAGE AUTEURS '
Alle auteurs namen deel aan de opvatting van het manuscript. Daarnaast TKMcG gestart van het project, experimentele resultaten verzameld, heeft bijgedragen aan het schrijven van het manuscript en de kritische beoordeling. AR verzameld en geanalyseerd experimentele resultaten, de opstellers van het manuscript en bijgedragen aan de kritische beoordeling. LF verzamelde experimentele resultaten en heeft bijgedragen aan de kritische beoordeling van het manuscript. TFS en JGM bijgedragen aan de kritische beoordeling van het manuscript.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
| Micro-Adson forceps, serrated 12 cm | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Moria MC31 forceps, serrated-curved | Fine Science Tools | 11370-31 | |
| Iris scissors-tough cut, straight 11.5 cm | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Spring scissors-2.5 mm blades, straight | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Non-sterile blunt needle (18g x ½”) | Brico Medical Supplies Inc. | BN1805 | Endotracheal cannula |
| Non-sterile 5-0 silk suture | Seraflex | IDI58000 | |
| Phosphate buffered solution | Gibco | 14190-144 | |
| 15 ml conical tubes | Starstedt | SS-4001 | |
| 1 ml TB syringes | Becton Dickinson | 309626 | |
| 200 μl filter tips | Biosphere | 70.760.211 | |
| EQUIPMENT | |||
| flexiVent FX | SCIREQ Inc. | sales@scireq.com | www.scireq.com |
| Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. | sales@scireq.com | www.scireq.com |
References
- Bates, J. H. T., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J. Appl. Physiol. 94, 1297-1306 (2003).
- Bates, J. H. T. . Lung mechanics. An inverse modeling approach. , (2009).
- Hantos, Z., Daroczy, B., Suki, B., Nagy, S., Fredberg, J. J. Input impedance and peripheral inhomogeneity in dog lungs. J. Appl. Physiol. 72, 168-178 (1992).
- McGovern, T. K., et al. Dimethylthiourea protects against chlorine induced changes in airway function in a murine model of irritant induced asthma. Respir. Res. 11, 138 (2010).
- Hayes, R. D., Beach, J. R., Rutherford, D. M., Sim, M. R. Stability of methacholine chloride solutions under different storage conditions over a 9 month period. Eur. Respir. J. 11, 946-948 (1998).
- North, M. L., et al. Augmentation of arginase 1 expression by exposure to air pollution exacerbates the airways hyperresponsiveness in murine models of asthma. Respir. Res. 12, (2011).
- Siddiqui, S., et al. Site of allergic airway narrowing and the influence of exogenous surfactant in the brown norway rat. PloS ONE. 7, e29381 (2012).
- Cohen, J. C., Lundblad, L. K. A., Bates, J. H. T., Levitzky, M., Larson, J. E. The “Goldilocks Effect” in cystic fibrosis: identification of a lung phenotype in the cftr knockout and heterozygous mouse. BMC Genetics. 5, 21 (2004).
- Shalaby, K. H., Gold, L. G., Schuessler, T. F., Martin, J. G., Robichaud, A. Combined forced oscillation and forced expiration measurements in mice for the assessment of airway hyperresponsiveness. Respir Res. 11, 82 (2010).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. J. Appl. Physiol. 109, 1960-1968 (2010).
- Amatullah, H., et al. Comparative cardiopulmonary effects of size-fractionated airborne particulate matter. Inhalation Toxicology. 24, 161-171 (2012).
- Salazar, E., Knowles, J. H. An analysis of pressure-volume characteristics of the lungs. J. Appl. Physiol. 19, 97-104 (1963).
- Balakrishna, S., et al. Environmentally persistent free radicals induce airway hyperresponsiveness in neonatal rat lungs. Particle Fibre Tox. 8, 11 (2011).
- Fahmy, B., et al. In vitro and in vivo assessment of pulmonary risk associated with exposure to combustion generated fine particles. Environ. Toxicol. Pharmacol. 29, 173 (2010).
- Duguet, A., et al. Bronchial responsiveness among inbred mouse strains. Role of airway smooth-muscle shortening velocity. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 161, 839-848 (2000).
- Bozanich, E. M., et al. Developmental changes in airway and tissue mechanics in mice. J. Appl. Physiol. 99, 108-113 (2005).
- Schwartz, B. L., et al. Effects of central airway shunting on the mechanical impedance of the mouse lung. Ann. Biomed. Eng. 39, 497-507 (2011).
- De Vleeschauwer, S. I., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab Anim. 45, 81-89 (2011).
- Takubo, Y., et al. α1-Antitrypsin determines the pattern of emphysema and function in tobacco smoke-exposed mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166, 1596-1603 (2002).
- Salerno, F. G., et al. Effect of PEEP on induced constriction is enhanced in decorin-deficient mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1111-L1117 (2007).
- Therien, A. G., et al. Adenovirus IL-13-induced airway disease in mice. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 39, 26-35 (2008).
- Bates, J. H. T., Cojocaru, A., Lundblad, L. K. A. Bronchodilatory effect of deep inspiration on the dynamics of bronchoconstriction in mice. J. Appl. Physiol. 103, 1696-1705 (2007).
- Wagers, S. S., et al. Intrinsic and antigen-induced airway hyperresponsiveness are the result of diverse physiological mechanisms. J. Appl. Physiol. 102, 221-230 (2007).
- Collins, R. A., Sly, P. D., Turner, D. J., Herbert, C., Kumar, R. K. Site of inflammation influences site of hyperresponsiveness in experimental asthma. Respir. Physiol. Neurobiol. 139, 51-61 (2003).
- Bishai, J. M., Mitzner, W. Effect of severe calorie restriction on the lung in two strains of mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L356-L362 (2008).
- Song, W., et al. Postexposure administration of β2-agonist decreases chlorine-induced airway hyperreactivity in mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 45, 88-94 (2011).
- Hirota, J. A., Ellis, R., Inman, M. D. Regional differences in the pattern of airway remodeling following chronic allergen exposure in mice. Respir. Res. 7, 120 (2006).
- Llop-Guevara, A., et al. In vivo-to-in silico iterations to investigate aeroallergen-host interactions. PloS ONE. 3, e2426 (2008).
